miR-205对体外脓毒症心肌细胞模型细胞凋亡和炎症因子分泌的影响

谢 斌 邓 超 陈栩栩 苏 醒 王红梅

（中南大学湘雅医学院附属海口医院重症医学科，海口 570203）

脓毒症主要是指由微生物感染所引起的疾病，其以大量炎症因子释放、免疫抑制、细胞凋亡，最终诱导器官功能衰竭为特征［1］。脓毒症心肌损伤是脓毒症致死的重要原因。脓毒症发生早期就表现出心肌损伤，包括心肌功能收缩异常、心肌细胞结构改变、射血分数降低等等［2］。脓毒症心肌损伤的发生机制十分复杂，与心肌细胞炎症因子释放、氧化损伤、细胞凋亡等有关［3］。LPS 是常见的诱导脓毒症发生的病原微生物的主要致病成分，其可在体外激活心肌细胞凋亡和炎症反应，造成心肌损伤［4］。既往研究发现，脓毒症心肌损伤中miRNA 的调控作用十分关键，且miRNA 在心肌细胞功能调节中发挥重要作用［5］。miRNA 是一类内源性的小分子RNA，可通过调控下游信号通路的转导、蛋白表达进而调控细胞和组织器官功能［6］。miR-205 是现阶段发现的与肿瘤有关的调节因子，在肿瘤细胞的转移、凋亡中发挥作用［7］。最近的研究发现，miR-205还与脓毒症有关，其在脓毒症患者的血清中低表达，且miR-205表达越低，患者的预后情况越差［8］。在外界因素刺激引起的心肌损伤中发现miR-205 降低PM2.5 诱发的心肌细胞凋亡［9］。NF-κB 信号通路是一个在脓毒症心肌损伤中具有促进作用的诱导因素，其激活可加剧脓毒症导致的器官功能损伤［10］。目前对于miR-205在脓毒症心肌细胞损伤中的作用尚不清楚。本实验以LPS诱导构建体外脓毒症心肌细胞损伤模型，研究miR-205 在脓毒症心肌细胞凋亡、炎症因子释放、氧化损伤中的作用和可能机制，为靶向基因治疗脓毒症提供可能参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级SD 雄性大鼠，体质量260～280 g，购自海南省医学实验动物中心，按照12 h光照以及12 h 黑暗环境进行饲养，不限制饮水以及采食。

1.1.2 细胞与试剂 大鼠心肌细胞H9c2购自通派（上海）生物科技有限公司；LDH 检测试剂盒、MDA检测试剂盒、SOD 检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；miRNA 第一链cDNA 合成试剂盒购自赛尔瑞成（北京）生命科学技术有限公司；SYBR Premix Ex Taq miRNA kit 购自武汉科昊佳生物科技有限公司；TNF-α 检测试剂盒、IL-6 检测试剂盒购自深圳子科生物科技有限公司；mimics control、miR-205 mimics 由百奥迈科生物技术有限公司构建合成；C-Caspase-3、NF-κBp65、GAPDH 抗体、二抗购自美国Abcam；GSH-Px 检测试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脓毒症大鼠模型构建 参照文献［11］构建脓毒症大鼠模型，步骤简述为：以10%水合氯醛对大鼠进行腹腔麻醉，将大鼠固定在操作台上，沿腹中线位置在下腹部切开3 cm 的切口，将肌肉分离，找出盲肠，在靠近盲肠末端5 cm 处用丝线结扎，用9号针头贯穿盲肠2次，小心挤压肠管促进粪便从穿刺点溢出，将盲肠放回腹腔，关闭腹腔。手术结束以后，皮下注射生理盐水（剂量为30 ml/kg）补充体液。手术结束以后，大鼠禁食，不限制饮水。将构建成功的脓毒症大鼠模型记为脓毒症组，同时设置正常组，正常组大鼠只进行盲肠探查术，不进行结扎。淘汰造模过程中死亡的大鼠，脓毒症大鼠模型10 只中死亡1 只（死亡率为10%），将正常组的10 只大鼠中随机淘汰1 只，两组大鼠各剩余9 只。造模后12 h，取大鼠心肌组织用于后续实验。

1.2.2 qRT-PCR 方法分析miR-205 表达 分别用Trizol 试剂提取心肌组织中的总RNA，然后在RNA内添加无RNA 酶水溶解RNA，RNA 置于-20 ℃条件下备用。本次实验采用miRNA第一链cDNA合成试剂盒进行反转录反应，反应体系包括：1µl Stem-loop primer、4 µl miRNA、10 µl 2×miRNA L-RT Solution mix、1.5µl miRNA L-RT Enzyme mix，然后用RNasefree water 补充总体积至20 µl，均匀混合后置于16 ℃条件下温浴30 min，然后以37 ℃条件温浴30 min，在85 ℃条件下反应5 min，将合成的cDNA置于-20 ℃备用。按照SYBR Premix Ex Taq miRNA kit进行PCR 反应，PCR 反应的体系包括：1 µl Reverse Primer、1µl cDNA、12.5µl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、1 µl Forward Primer，然后用ddH2O 补充至25 µl，PCR 仪反应的程序设置如下：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，55 ℃30 s，一共进行45 个循环，把U6 设置成内参，采用2-ΔΔCt法分别计算miR-205 的表达变化。本次PCR 使用的引物序列为：U6 正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACCCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-205 正向引物5'-GCCGTCCTTCATTCCACCG-3'，反向引物5'-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3'。

1.2.3 TNF-α、IL-6 水平检测 收集心肌组织，ELISA法检测TNF-α、IL-6水平，步骤分别按照TNF-α检测试剂盒和IL-6检测试剂盒操作说明书进行。

1.2.4 TUNEL 法检测细胞凋亡 将心肌组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，常规方法制备5µm 厚的切片，用二甲苯洗涤2 次，在梯度乙醇中浸泡1 次，分别滴加Proteinase K 溶液继续孵育20 min，加入50µl TUNEL 溶液，置于暗湿盒中反应1 h。最后添加50 µl converter-POD，放在暗湿盒内反应30 min。以DAB 染色，以苏木素复染之后计数细胞凋亡指数。

1.2.5 细胞转染以及分组 大鼠心肌细胞H9c2分为Control 组、LPS 组、miR-NC+LPS 组和miR-205+LPS 组，其中LPS、miR-NC+LPS、miR-205+LPS 组细胞分别在实验开始时培养在含有1 mg/L LPS的细胞培养液内，miR-NC+LPS、miR-205+LPS 组心肌细胞在LPS 培养之前，需转染mimics control、miR-205 mimics，Control 组细胞不做处理。细胞转染的方法和具体操作步骤按照转染试剂Lipofectamine2000说明书进行。培养24 h 后，收集各组心肌细胞培养液上清，按照1.2.3方法检测TNF-α、IL-6水平。

1.2.6 CCK-8 方法检测细胞凋亡 将各组心肌细胞分别接种至96 孔板，接种浓度约3×104个/ml，将细胞置于CO2培养箱中，培养24 h后取出培养板，分别在每孔内添加10µl的CCK-8溶液，将细胞板置于孔板振荡仪内充分混合1 min，再把细胞培养板置于CO2培养箱中孵育4 h。取出培养板后用酶标仪检测每孔的OD 值，计算存活率：存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组培养24 h 后的心肌细胞，PBS 洗涤2 次，配制成浓度为5×105个/ml的细胞悬液。用移液枪分别吸取1 ml的细胞悬浮液于离心管内，800 g 离心10 min，继续在细胞沉淀中添加200 µl 的结合缓冲溶液，再吸取5µl的Annexin V-FITC 以及5µl的PI染色液至细胞中，混合溶液避光在室温下结合10 min。然后再次添加300µl 的结合缓冲溶液，利用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.2.8 Western blot 分析C-Caspase-3、NF-κBp65 蛋白表达 收集各组培养24 h 后的心肌细胞，PBS 润洗2次，添加RIPA裂解试剂，放在冰上充分裂解反应20 min。取蛋白样品，根据BCA方法测定浓度后，在蛋白内缓缓加入与蛋白溶液等体积的2×Loading Buffer，100 ℃煮沸5 min，促进蛋白变性。然后按照常规方法配制SDS-PAGE 凝胶（分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%），分别吸取40 µg 的蛋白添加到点样孔中，打开电源，首先按照80 V 的条件在浓缩胶中电泳，在溴酚蓝即将要到达分离胶时，更换为120 V 的电压继续电泳，在溴酚蓝染料已经到达底部以后，关闭电源。将凝胶取出，然后和裁剪以后的NC膜放在转移缓冲液内备用。设置250 mA的恒流进行转膜，转膜操作需要在冰上进行。转膜结束后，将NC 膜置于封闭液（5%牛血清白蛋白）中，放在室温下结合1 h。NC 膜放在抗体孵育袋内，一抗C-Caspase-3、NF-κBp65 抗体按照1∶500、1∶800 进行稀释，4 ℃过夜孵育，再用二抗用封闭液按照1∶2 000进行稀释，孵育1 h，然后按照ECL 方法进行显色。利用软件分析各条带的灰度值，并将GAPDH 作为参照，分析目的蛋白的表达水平。

1.2.9 LDH、MDA、SOD、GSH-Px 水平检测 收集各组培养24 h 后的培养液上清和心肌细胞，检测培养液上清中LDH 水平，检测细胞中MDA、SOD、GSH-Px 水平，操作步骤分别按照LDH 检测试剂盒（二硝基苯肼法）、MDA 检测试剂盒（硫代巴比妥酸法）、SOD 检测试剂盒（黄嘌呤法）、GSH-Px检测试剂盒说明书进行（比色法）。

1.2.10 NF-κB 信号激活剂对miR-205 的作用检测 经转染miR-205 mimics 的心肌细胞用1 mg/L LPS和1µmol/L的NF-κB信号激活剂PMA的培养液培养，记为miR-205+PMA+LPS 组，设置miR-205+LPS组为参照，按照上述相关方法检测细胞增殖、凋亡和C-Caspase-3、NF-κBp65蛋白表达和LDH、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6水平。

1.3 统计学分析 用SPSS21.0 软件分析数据，计量资料用±s表示，两组数据间比较用t检验，多组差异比较用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-205 在脓毒症大鼠心肌组织中低表达与正常组相比，脓毒症大鼠模型心肌组织中miR-205 表达水平降低，心肌组织中TNF-α、IL-6 水平升高，细胞凋亡指数升高。见表1。提示脓毒症大鼠心肌组织中炎症因子水平增加，细胞凋亡增多，miR-205在脓毒症大鼠心肌组织中低表达。

表1 脓毒症大鼠心肌组织中miR-205 表达水平、炎症因子和细胞凋亡指数（±s，n=10）Tab.1 Expression level of miR-205，inflammatory fac⁃tors and apoptosis index in myocardial tissue of sepsis rats（±s，n=10）

表1 脓毒症大鼠心肌组织中miR-205 表达水平、炎症因子和细胞凋亡指数（±s，n=10）Tab.1 Expression level of miR-205，inflammatory fac⁃tors and apoptosis index in myocardial tissue of sepsis rats（±s，n=10）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05.

Apoptosis index/%5.18±0.26 39.56±4.251）24.223<0.001 Groups Normal Sepsis tP miR-205 1.00±0.11 0.56±0.061）10.535<0.001 TNF-α/（pg·g-1）90.65±75.16 226.14±12.941）5.330<0.001 IL-6/（pg·g-1）156.27±13.84 497.22±17.231）46.282<0.001

2.2 miR-205 mimics 对LPS 诱导的心肌细胞增殖和凋亡影响 与Control 组相比，LPS 组心肌细胞中miR-205 水平降低，细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，细胞中C-Caspase-3 蛋白表达增多，差异有统计学意义（P<0.05）。与miR-NC+LPS 组相比，miR-205+LPS 组心肌细胞中miR-205 水平升高，细胞存活率升高，细胞凋亡率降低，细胞中C-Caspase-3 蛋白表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1和表2。提示miR-205 mimics 提高LPS 诱导的心肌细胞增殖活性，抑制细胞凋亡。

表2 miR-205 mimics转染后LPS诱导的心肌细胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平（±s，n=9）Tab.2 Effects of miR-205 mimics on LPS-induced cardiomyocyte survival rate，apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level（±s，n=9）

表2 miR-205 mimics转染后LPS诱导的心肌细胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平（±s，n=9）Tab.2 Effects of miR-205 mimics on LPS-induced cardiomyocyte survival rate，apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level（±s，n=9）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miR-NC+LPS group，2）P<0.05.

miR-205 1.00±0.09 0.53±0.041）0.52±0.06 1.15±0.122）135.942<0.001 Groups Control LPS miR-NC+LPS miR-205+LPS FP Survival rate/%100.00±10.23 52.03±6.411）53.18±5.59 75.20±6.332）84.742<0.001 Apoptosis rate/%5.69±0.41 34.15±2.691）35.17±2.74 15.36±1.252）458.731<0.001 C-Caspase-3 protein 0.26±0.03 0.85±0.081）0.86±0.07 0.46±0.052）216.338<0.001

图1 miR-205 mimics 转染后LPS 诱导的心肌细胞凋亡变化Fig. 1 Changes of cardiomyocyte apoptosis induced by LPS after miR-205 mimics transfection

2.3 miR-205 mimics 对LPS 诱导的心肌细胞氧化损伤影响 与Control 组相比，LPS 组心肌细胞培养液上清中LDH 水平升高，细胞中MDA 水平升高，SOD、GSH-Px 水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与miR-NC+LPS 组相比，miR-205+LPS 组心肌细胞培养液上清中LDH 水平降低，细胞中MDA水平降低，SOD、GSH-Px 水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。提示miR-205 mimics 减弱LPS诱导的心肌细胞氧化损伤。

表3 miR-205 mimics 对LPS 诱导的心肌细胞LDH、MDA、SOD、GSH-Px 水平的影响（±s，n=9）Tab.3 Effects of miR-205 mimics on LPS-induced levels of LDH，MDA，SOD and GSH-Px in cardiomyocytes（±s，n=9）

表3 miR-205 mimics 对LPS 诱导的心肌细胞LDH、MDA、SOD、GSH-Px 水平的影响（±s，n=9）Tab.3 Effects of miR-205 mimics on LPS-induced levels of LDH，MDA，SOD and GSH-Px in cardiomyocytes（±s，n=9）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miR-NC+LPS group，2）P<0.05.

GSH-Px/（U·g-1）569.37±41.02 227.48±13.501）224.91±14.02 334.17±28.142）330.340<0.001 Groups Control LPS miR-NC+LPS miR-205+LPS FP LDH/（U·L-1）4.77±0.41 32.01±2.561）31.40±3.69 13.84±1.122）301.819<0.001 MDA/（µmol·g-1）9.86±0.78 26.32±2.211）25.78±2.30 16.74±1.312）178.941<0.001 SOD/（U·g-1）185.22±15.32 102.30±8.461）101.20±10.27 159.64±13.322）108.426<0.001

2.4 miR-205 mimics 对LPS 诱导的心肌细胞分泌炎症因子影响 与Control 组相比，LPS 组心肌细胞培养液上清中TNF-α、IL-6 水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与miR-NC+LPS 组相比，miR-205+LPS组心肌细胞培养液上清中TNF-α、IL-6水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。提示miR-205 mimics减弱LPS诱导的心肌细胞炎症因子释放。

表4 miR-205 mimics 转染后LPS 诱导的心肌细胞培养液上清中TNF-α、IL-6水平（±s，n=9）Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in culture supernatant of cardiomyocytes induced by LPS after miR-205 mimics transfection（±s，n=9）

表4 miR-205 mimics 转染后LPS 诱导的心肌细胞培养液上清中TNF-α、IL-6水平（±s，n=9）Tab.4 Levels of TNF-α and IL-6 in culture supernatant of cardiomyocytes induced by LPS after miR-205 mimics transfection（±s，n=9）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miRNC+LPS group，2）P<0.05.

IL-6/（ng·L-1）512.02±43.26 1 684.20±126.021）1 689.14±152.78 1 034.63±65.792）256.464<0.001 Groups Control LPS miR-NC+LPS miR-205+LPS tP TNF-α/（ng·L-1）85.99±7.16 190.86±13.691）191.77±16.48 113.03±10.542）169.836<0.001

2.5 miR-205对LPS诱导的心肌细胞中NF-κB信号通路的影响 与Control 组相比，LPS 组心肌细胞中NF-κBp65 蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与miR-NC+LPS组相比，miR-205+LPS组心肌细胞中NF-κBp65蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2 和表5。提示miR-205 mimics减弱LPS诱导的心肌细胞中NF-κB信号。

图2 Western blot法分析miR-205 mimics转染后LPS诱导的心肌细胞中NF-κBp65蛋白表达水平Fig.2 Western blot analysis of NF-κBp65 protein expres⁃sion in cardiomyocytes induced by LPS after miR-205 mimics transfection

表5 miR-205 mimics 转染后LPS 诱导的心肌细胞中NFκBp65蛋白水平（±s，n=9）Tab.5 NF-κBp65 protein level in cardiomyocytes induced by LPS after miR-205 mimics transfection（±s，n=9）

表5 miR-205 mimics 转染后LPS 诱导的心肌细胞中NFκBp65蛋白水平（±s，n=9）Tab.5 NF-κBp65 protein level in cardiomyocytes induced by LPS after miR-205 mimics transfection（±s，n=9）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miRNC+LPS group，2）P<0.05.

NF-κBp65 protein 0.26±0.03 0.77±0.091）0.80±0.06 0.39±0.042）186.338<0.001 Groups Control LPS miR-NC+LPS miR-205+LPS FP

2.6 NF-κB信号通路激活剂对miR-205调控的LPS诱导的心肌细胞凋亡、氧化损伤及炎症因子释放的影响 与miR-205+LPS 组相比，miR-205+PMA+LPS组心肌细胞存活率降低，凋亡率升高，细胞中C-Cas⁃pase-3、NF-κBp65蛋白水平升高，上清中LDH、TNF-α、IL-6水平升高，细胞中MDA 水平升高，SOD、GSH-Px水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表6 和图3。提示NF-κB 信号通路激活剂逆转miR-205 调控的LPS 诱导的心肌细胞凋亡、氧化损伤以及炎症因子释放作用。

图3 NF-κB 信号激活剂对上调miR-205 影响LPS 诱导的心肌细胞凋亡的作用Fig.3 Effect of NF-κB signal activator on up-regulation of miR-205 and LPS-induced cardiomyocyte apoptosis

表6 miR-205 mimics 转染以后LPS 诱导的心肌细胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3、NF-κBp65 蛋白水平以及LDH、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6水平（±s，n=9）Tab.6 LPS-induced cardiomyocyte survival rate，apoptosis rate，C-Caspase-3，NF-κBp65 protein levels and LDH，MDA，SOD，GSH-Px，TNF-α，IL-6 levels after miR-205 mimics transfection level（±s，n=9）

表6 miR-205 mimics 转染以后LPS 诱导的心肌细胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3、NF-κBp65 蛋白水平以及LDH、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-6水平（±s，n=9）Tab.6 LPS-induced cardiomyocyte survival rate，apoptosis rate，C-Caspase-3，NF-κBp65 protein levels and LDH，MDA，SOD，GSH-Px，TNF-α，IL-6 levels after miR-205 mimics transfection level（±s，n=9）

Note：Compared with miR-205+LPS group，1）P<0.05.

Groups LDH/（U·L-1）MDA/（µmol·g-1）SOD/（U·g-1）GSH-Px/（U·g-1）TNF-α/（ng·L-1）IL-6/（ng·L-1）Survival rate/%Apoptosis rate/%C-Caspase-3 protein NF-κBp65 protein miR-205+LPS miR-205+PMA+LPS 100.00±9.56 14.87±1.39 0.45±0.04 0.36±0.03 12.47±1.23 15.84±1.66 160.84±15.58 320.62±20.99 110.86±9.96 1 010.22±114.50 63.25±5.201）28.45±2.261）0.73±0.071）0.78±0.051）26.14±2.311）20.10±1.201）120.84±10.641）240.16±16.731）188.74±15.231）1 472.30±124.861）tP 12.131<0.001 15.355<0.001 10.419<0.001 21.609<0.001 15.670<0.001 6.239<0.001 6.360<0.001 8.993<0.001 12.839<0.001 8.138<0.001

3 讨论

miRNA 有多种作用，在机体疾病发生、正常胚胎发育等过程中均有调控功能。miRNA 没有开放阅读框，长度在20 nt 左右，其在多种生物体内普遍表达［12］。miRNA 和人类疾病的关系已经有很多研究报道，例如，miRNA 通过调控肿瘤细胞的侵袭、生长、凋亡影响肿瘤进程，miRNA 还与动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、关节炎等有关［13］。近些年来，很多研究证明在脓毒症心肌损伤中同样存在miRNA 的异常表达，且miRNA 还可能是脓毒症治疗的靶点［5］。miR-205 是一个参与调控肿瘤发生的调节因子，与肿瘤细胞的生长、凋亡等有关［7］。后续研究证明，miR-205 还和脓毒症有关，其在脓毒症患者中低表达与其预后不良具有相关性［8］。在PM2.5诱导的心肌细胞损伤中发现miR-205 表达下调，而上调miR-205抑制心肌细胞凋亡［9］。本研究结果显示，脓毒症大鼠心肌组织中miR-205 表达下调，而且miR-205 在LPS 诱导的体外脓毒症心肌细胞损伤模型中也表达下调，LPS 诱导心肌细胞增殖抑制和促进凋亡，而上调miR-205能够提高心肌细胞增殖活性，减少细胞凋亡，这说明miR-205 在脓毒症心肌损伤中可能发挥保护作用。

脓毒症的发生是一个极为复杂的过程，其造成的心肌损伤与细胞凋亡、炎症因子释放、氧化损伤等具有密切关系［14］。研究显示，脓毒症条件下，大量的TNF-α、IL-6 等炎症因子能够诱导机体内产生过多的氧自由基，加上抗氧化酶如SOD、GSH-Px 的活性下降，这些氧自由基并不能被及时清除，进而聚集在细胞内［15］。过量的氧自由基不仅会造成氧化损伤，还会激活细胞凋亡，首先，氧自由基能够促进细胞内的脂质发生过氧化，产生MDA，同时脂质是细胞膜的主要成分，这就导致了细胞膜被破坏，原本存在于细胞内的LDH 被释放至细胞外，因此，检测MDA 和LDH 水平的变化能够间接反映细胞氧化损伤程度［16］。其次，氧自由基还可以激活细胞内的Caspase 级联反应，最终诱导细胞凋亡的发生［17］。Caspase-3 是Caspase 蛋白家族成员之一，其活化形成剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，CCaspase-3）后可以不可逆地催化细胞凋亡发生［18］。本实验表明，miR-205 能够抑制LPS 诱导的心肌细胞中C-Caspase-3 的表达，减少TNF-α、IL-6 释放，降低MDA 和LDH 水平，提高SOD、GSH-Px 水平，提示miR-205 具有抑制LPS 诱导的心肌细胞凋亡、氧化损伤和炎症因子释放的作用。

NF-κB 信号通路是炎症反应的经典信号通路，其被激活后可以诱导下游一系列炎症反应，促进炎症损伤［19］。另外，NF-κB 信号还参与细胞凋亡及氧化应激过程。NF-κBp65 是NF-κB 信号的关键亚单位，也是其激活水平的标志［20-21］。既往研究已经证明，NF-κB 信号活化促进脓毒症损伤，而抑制NF-κB信号活化可改善脓毒症多器官损伤［22-23］。本研究表明，miR-205 降低LPS 诱导的心肌细胞中NF-κBp65蛋白表达水平，而NF-κB 信号激活剂逆转miR-205对LPS 诱导的心肌细胞凋亡、氧化损伤和炎症因子释放作用，提示miR-205 作用机制可能与NF-κB有关。

综上，miR-205 在脓毒症心肌组织中表达下调，上调miR-205 可能通过作用于NF-κB 信号通路抑制LPS 诱导的心肌细胞凋亡、氧化损伤和炎症因子释放，目前对miR-205 是通过何种机制影响NF-κB 信号通路进而调控心肌损伤的机制还不清楚，课题组在以后实验中会进行详细探讨。本实验结果为研究miR-205 在脓毒症心肌损伤中的作用提供了参考，为靶向基因治疗脓毒症心肌损伤提供了资料。