亚麻木酚素对TGF-β1诱导的心肌细胞H9C2损伤的影响

王玉燕 铁虎光 金丽山 马万程 （青海省第五人民医院心血管内科，西宁 810000）

心肌损伤是心血管系统疾病（如心力衰竭、心肌纤维化等）发生的重要原因之一，心肌细胞是心肌损伤的关键细胞［1］。研究表明，氧化损伤、细胞凋亡等是心肌细胞损伤的发生机制，细胞内过量活性氧（reactive oxygen species，ROS）可诱发细胞氧化损伤和凋亡［2］。TGF-β1 是心力衰竭、心肌纤维化等的重要诱导因子，可诱导心肌细胞凋亡和氧化损伤［3］。亚麻木酚素（secoisolariciresinol diglucoside，SDG）是亚麻籽的有效活性成分之一，具有降血脂、抗氧化、预防心血管系统疾病、消炎、抗肿瘤等生物学功能［4］。研究发现，SDG 可改善心肌功能，对脓毒症引发的心脏功能损伤和氧化应激具有治疗效果［5］。SDG 处理后铁超载引发的心肌损伤程度明显降低，细胞凋亡和抗氧化酶活性改善［6］。SDG 在体外可抑制氧化应激引起的心肌细胞凋亡，且可与JAK2/STAT3 协同发挥作用［7］。目前SDG 在TGF-β1 诱导的心肌细胞损伤中的作用尚不明确。本研究以心肌细胞H9C2 为研究对象，通过CCK-8、Western blot、流式细胞术等常规实验手段研究SDG 的功能，为SDG治疗心肌损伤的临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 心肌细胞H9C2 购自通派（上海）生物科技有限公司；SDG 购自成都普瑞法科技开发有限公司；LDH 检测试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司；JAK2 抗体购自美国Cell Signaling Technology；MDA 检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；STAT3 抗体购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司；SOD检测试剂盒、ROS检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；C-Caspase-3、p-JAK2、p-STAT3抗体购自美国santacruze；TGF-β1购自南京欧凯生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 测定SDG 对心肌细胞增殖活性的影响 调整心肌细胞浓度为3×104个/ml，吸取100 µl细胞悬浮液接种至96孔板，饱和湿度、37 ℃，5%CO2培养12 h，弃上清，更换为含0、50、100、200、400、800 µmol/L SDG 的细胞培养液继续培养24 h，取出细胞，10µl/孔添加CCK-8 溶液均匀混合，继续培养2 h，取出培养板，酶标仪检测450 nm 处OD 值。以0µmol/L SDG 处理的细胞存活率为100%，分析各浓度SDG处理的细胞存活率变化。

1.2.2 细胞分组 心肌细胞分为对照组、模型组、SDG 低、中、高剂量组。对照组不做任何处理；模型组给予20 ng/ml TGF-β1 细胞培养液处理；SDG 低、中、高剂量组同时给予20 ng/ml TGF-β1 和50、100、200 µmol/L SDG 处理。各组细胞培养24 h 后按

1.2.1检测细胞增殖情况。

1.2.3 LDH、MDA、ROS、SOD 水平检测 各组细胞培养24 h 后收集细胞和上清，按照LDH、MDA、ROS、SOD 检测试剂盒说明分别检测上清和细胞中LDH 水平、细胞中MDA、ROS、SOD 水平。ROS 结果以相对荧光强度表示（对照组荧光强度设为1），计算LDH相对释放率（对照组LDH释放率设为100%）。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞按照上述方法培养24 h 后，加入0.25%胰蛋白酶制备单细胞悬浮液，PBS 洗涤2 次，加入400µl 结合缓冲溶液混合，分别加入5µl Annexin V-FITC 及5µl PI 室温反应15 min，流式细胞仪测定细胞凋亡情况。

1.2.5 Western blot检测C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表达 各组细胞按上述方法培养24 h 后，加入含PMSF 的RIPA 裂解溶液冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 g 离心10 min，取上清，-20 ℃保存，常规BCA 法检测蛋白浓度，按1∶4 添加5×蛋白上样缓冲液，涡旋振荡，沸水中孵育5 min，安装洗涤干净的玻璃板，制备8%分离胶、5%浓缩胶，30 µg/孔加入蛋白样品，80 V 电泳30 min，蛋白进入分离胶后，100 V继续电泳1 h，溴酚蓝指示剂进入凝胶底部边缘时取出凝胶，置于转移缓冲液中。将裁剪好的PVDF 膜浸泡于无水乙醇，置于转移缓冲液中备用，转膜（4 ℃、100 V），浸泡于含5%牛血清白蛋白的溶液中室温摇晃60 min，加入一抗稀释液4 ℃摇床结合过夜，加入二抗稀释液室温摇晃孵育60 min，ECL显色，Image J分析条带灰度值。目的蛋白表达=目的条带灰度值/内参条带灰度值，C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 抗体稀释倍数分别为1∶400、1∶800、1∶600、1∶800、1∶600。

1.2.6 JAK2/STAT3 信号抑制剂对SDG 调控心肌细胞的影响 采用20 ng/ml TGF-β1、100 µmol/L SDG 和5 µmol/L JAK2/STAT3 信号抑制剂AG490 处理心肌细胞，记为SDG-M+AG490 组，以SDG-M 组为对照，培养24 h 后按1.2.1 检测细胞增殖，按1.2.3检测MDA、ROS、SOD、LDH 水平，按1.2.4 检测细胞凋亡，按1.2.5 检测C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0 软件分析数据，计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SDG对心肌细胞增殖的影响 与0µmol/L SDG组相比，50、100、200µmol/L SDG处理的心肌细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05），而400、800µmol/L SDG处理的心肌细胞存活率明显降低（P<0.05，表1），因此，选择对心肌细胞增殖活性无影响的50、100、200µmol/L SDG进行后续实验。

表1 不同浓度SDG处理后心肌细胞存活率（±s，%）Tab.1 Survival rate of cardiomyocytes treated with different concentrations of SDG（±s，%）

表1 不同浓度SDG处理后心肌细胞存活率（±s，%）Tab.1 Survival rate of cardiomyocytes treated with different concentrations of SDG（±s，%）

Note：Compared with 0µmol/L group，1）P<0.05.

Survival rate 100.00±10.47 97.38±12.56 95.47±9.14 94.78±13.07 80.20±7.151）63.01±4.211）18.632<0.001 Concentration of SDG 0µmol/L 50µmol/L 100µmol/L 200µmol/L 400µmol/L 800µmol/L FP

2.2 SDG 对TGF-β1 诱导的心肌细胞增殖和LDH释放的影响 与对照组相比，模型组心肌细胞存活率降低，LDH 释放率升高（P<0.05）；与模型组相比，SDG 低、中、高剂量组心肌细胞存活率升高，LDH 释放率降低（P<0.05，表2），且呈剂量依赖性，提示SDG 可促进TGF-β1 诱导的心肌细胞增殖，抑制LDH释放。

表2 各组心肌细胞存活率和LDH释放率（±s，%）Tab.2 Cardiomyocytes survival rate and LDH release rate in each group（±s，%）

表2 各组心肌细胞存活率和LDH释放率（±s，%）Tab.2 Cardiomyocytes survival rate and LDH release rate in each group（±s，%）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with SDG-L group，3）P<0.05；compared with SDG-M group，4）P<0.05.

LDH release rate 100.00±5.14 284.31±12.011）210.64±15.202）154.23±13.022）3）120.47±11.492）3）4）392.226<0.001 Groups Control Model SDG-L SDG-M SDG-H FP Survival rate 100.00±9.95 52.24±5.521）65.32±6.912）78.46±6.672）3）93.47±7.302）3）4）63.371<0.001

2.3 SDG对TGF-β1诱导的心肌细胞氧化损伤的影响 与对照组相比，模型心肌细胞MDA和ROS水平升高，SOD 水平降低（P<0.05）；与模型组相比，SDG低、中、高剂量组心肌细胞MDA 和ROS 水平降低，SOD 水平升高（P<0.05，表3），且呈剂量依赖性，提示SDG可抑制TGF-β1诱导的心肌细胞氧化损伤。

表3 各组心肌细胞MDA、ROS、SOD水平（±s）Tab.3 MDA，ROS and SOD levels of cardiomyocytes in each group（±s）

表3 各组心肌细胞MDA、ROS、SOD水平（±s）Tab.3 MDA，ROS and SOD levels of cardiomyocytes in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with SDG-L group，3）P<0.05；compared with SDG-M group，4）P<0.05.

Groups MDA/（nmol·mg-1）SOD/（U·mg-1）FP Control Model SDG-L SDG-M SDG-H 6.69±0.47 15.47±1.231）12.01±1.042）9.62±0.632）3）7.01±0.512）3）4）154.919<0.001 ROS/Relative fluo⁃rescence intensity 1.00±0.12 3.69±0.201）2.84±0.222）2.01±0.162）3）1.40±0.102）3）4）370.925<0.001 12.02±1.30 4.12±0.311）6.81±0.442）8.12±0.632）3）11.45±0.782）3）4）163.742<0.001

2.4 SDG 对TGF-β1 诱导的心肌细胞凋亡的影响与对照组相比，模型组心肌细胞凋亡率升高，C-Caspase-3 蛋白表达增多（P<0.05）；与模型组相比，SDG 低、中、高剂量组心肌细胞凋亡率降低，C-Caspase-3 蛋白表达减少（P<0.05，图1、表4），且呈剂量依赖性。提示SDG 可抑制TGF-β1 诱导的心肌细胞凋亡。

表4 各组心肌细胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平（±s）Tab.4 Apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level of cardiomyocytes in each group（±s）

表4 各组心肌细胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平（±s）Tab.4 Apoptosis rate and C-Caspase-3 protein level of cardiomyocytes in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with SDG-L group，3）P<0.05；compared with SDG-M group，4）P<0.05.

C-Caspase-3 protein 0.36±0.04 0.96±0.091）0.63±0.062）0.42±0.042）3）0.34±0.032）3）4）177.403<0.001 Groups Control Model SDG-L SDG-M SDG-H FP Apoptosis rate/%7.03±0.52 29.51±3.261）20.45±1.372）14.29±1.302）3）10.08±1.122）3）4）226.030<0.001

图1 SDG对心肌细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of SDG on cardiomyocytes apoptosis

2.5 SDG 对TGF-β1 诱导的心肌细胞JAK2/STAT3信号通路的影响 与对照组相比，模型组心肌细胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达降低（P<0.05）；与模型组相比，SDG 低、中、高剂量组心肌细胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达增多（P<0.05，图2、表5），且呈剂量依赖性。提示SDG 可促进TGF-β1 诱导的心肌细胞JAK2/STAT3信号通路激活。

表5 各组心肌细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平（±s）Tab.5 JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 protein levels of cardiomyocytes in each group（±s）

表5 各组心肌细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平（±s）Tab.5 JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 protein levels of cardiomyocytes in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with SDG-L group，3）P<0.05；compared with SDG-M group，4）P<0.05.

p-STAT3 0.69±0.06 0.28±0.041）0.36±0.032）0.55±0.062）3）0.64±0.062）3）4）127.423<0.001 Groups Control Model SDG-L SDG-M SDG-H FP JAK2 0.85±0.08 0.88±0.10 0.86±0.09 0.87±0.07 0.88±0.09 0.204 0.893 p-JAK2 0.75±0.07 0.26±0.031）0.34±0.042）0.52±0.052）3）0.68±0.072）3）4）171.970<0.001 STAT3 0.83±0.08 0.82±0.07 0.84±0.09 0.85±0.07 0.83±0.06 0.247 0.863

图2 Western blot检测SDG对各组心肌细胞JAK2/STAT3信号通路关键蛋白表达的影响Fig.2 Western blot to detect effect of SDG on key protein expressions of JAK2/STAT3 signaling pathway in cardiomyocytes in each group

2.6 JAK2/STAT3 信号抑制剂AG490 对心肌细胞增殖、LDH释放、凋亡和氧化损伤的影响 与SDG-M 组相比，SDG-M+AG490 组心肌细胞存活率降低，LDH释放率升高，凋亡率升高，MDA、ROS水平升高，SOD水平降低，C-Caspase-3 蛋白表达增多，p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达减少（P<0.05，图3、表6）。提示JAK2/STAT3 信号抑制剂AG490 可逆转SDG 对TGF-β1 诱导的心肌细胞增殖、LDH 释放、凋亡和氧化损伤的作用。

图3 JAK2/STAT3 抑制剂AG490 对SDG 处理的心肌细胞凋亡和C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响Fig.3 Effect of JAK2/STAT3 inhibitor AG490 on apoptosis and protein expressions of C-Caspase-3，JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 of cardiomyocytes after SDG treatment

表6 SDG 和JAK2/STAT3 抑制剂AG490 处理后各组心肌细胞存活率、LDH 释放率、凋亡率、MDA、ROS、SOD 水平及C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达（±s）Tab.6 Cardiomyocytes survival rate，LDH release rate，apoptosis rate，MDA，ROS，SOD levels and C-Caspase-3，JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 protein expressions after SDG and JAK2/STAT3 inhibitor AG490 treatment in each group（±s）

表6 SDG 和JAK2/STAT3 抑制剂AG490 处理后各组心肌细胞存活率、LDH 释放率、凋亡率、MDA、ROS、SOD 水平及C-Caspase-3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达（±s）Tab.6 Cardiomyocytes survival rate，LDH release rate，apoptosis rate，MDA，ROS，SOD levels and C-Caspase-3，JAK2，p-JAK2，STAT3，p-STAT3 protein expressions after SDG and JAK2/STAT3 inhibitor AG490 treatment in each group（±s）

Groups Survival rate/%LDH release rate/%MDA/（nmol·mg-1）SOD/（U·mg-1）Apoptosis rate/%C-Caspase-3 protein JAK2 p-JAK2 STAT3 p-STAT3 SDG-M SDG-M+AG490 100.00±9.61 100.00±11.02 9.78±0.86 ROS/Relative fluorescence intensity 1.00±0.08 7.69±0.74 12.98±1.53 0.46±0.05 0.88±0.09 0.50±0.07 0.84±0.09 0.52±0.08 80.10±7.22 169.32±12.58 13.65±1.24 2.56±0.18 5.62±0.58 24.10±2.26 0.71±0.07 0.86±0.08 0.29±0.04 0.83±0.06 0.30±0.05 tP 4.967 12.435 7.694 23.759 6.605 12.223 8.719 0.498 7.814 0.277 6.996<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 0.625<0.001 0.785<0.001

3 讨论

TGF-β1是常见的心肌细胞损伤因子，在心脏相关疾病中表达上调［8］。TGF-β1 可诱导心肌细胞凋亡和氧化损伤［3］。研究显示，心肌细胞受外界因素刺激后，ROS 无法被及时清除，导致ROS 在细胞内过度积累［2］。正常情况下，机体内低水平的ROS 对细胞信号转导具有重要作用，当ROS 水平异常升高时，可引起细胞内脂质过氧化，而脂质是细胞膜主要成分，导致原本存在于细胞内的LDH 被释放至细胞外，因此检测LDH 释放率能够反映细胞损伤程度［9］。MDA 是脂质过氧化产物［10］。机体内ROS 动态平衡受氧化系统和抗氧化系统双重作用，其中抗氧化酶如SOD 是抗氧化系统的关键组成部分，其活性降低后细胞内ROS 水平升高［11］。另外，细胞内ROS 异常聚集除引起氧化损伤外，还可激活细胞内Caspase凋亡级联反应，诱导细胞凋亡［12］。Caspase-3是Caspase 蛋白家族下游因子，在静息情况下以无活性的酶原形式存在，被剪切活化后才能不可逆地促进细胞凋亡［13］。本研究发现，TGF-β1刺激后的心肌细胞增殖活性降低，LDH 释放率升高，凋亡率升高，细胞中ROS 和MDA 水平升高，SOD 活性降低，C-Caspase-3 蛋白表达升高，提示TGF-β1 可诱导心肌细胞损伤，与既往研究结论相符。

多种植物均含有木酚素，而亚麻籽中木酚素含量最高，SDG 又称为开环异落叶松酚葡萄苷，具有改善肠道、促进成骨分化、抗氧化、抗肿瘤等功效［14］。研究显示，SDG 对心血管系统疾病也有改善作用［15］。SDG 灌胃后的慢性间歇性低氧小鼠心肌损伤明显改善，SDG 还可降低心肌组织中MDA 含量［16］。SDG 可减少离体缺血再灌注损伤模型心肌细胞凋亡水平，改善心肌梗死的心脏功能［17］。铁超载诱导的心肌损伤中发现，SDG 能够降低心肌细胞Caspase-3 活化水平，提高SOD 活性，减少细胞凋亡［6］。以上研究证实了SDG强大的抗氧化和抗细胞凋亡功能。本研究发现，SDG可提高TGF-β1诱导的心肌细胞增殖活性，减少LDH 释放，降低细胞凋亡水平，提高SOD 活性，降低ROS 和MDA 水平，抑制C-Caspase-3 蛋白表达，说明SDG 可改善TGF-β1 诱导的心肌细胞损伤，与既往研究结论一致，提示SDG在心肌损伤中发挥保护作用。

研究发现，SDG 作用发挥与调控信号转导和基因表达有关［16］。SDG 抑制氧化应激条件下心肌细胞凋亡的机制与激活JAK2/STAT3 信号有关［7］。JAK2/STAT3信号通路在机体内发挥多种作用，对组织生长、能量代谢、神经损伤、细胞生长等均有调控功能［18-20］。JAK2/STAT3发挥作用与JAK2、STAT3磷酸化有关，二者磷酸化水平升高是JAK2/STAT3 信号通路激活的标志［21-22］。研究表明，JAK2/STAT3 信号通路在心肌损伤中激活水平降低，且激活JAK2/STAT3信号通路可改善心肌损伤［7，23］。本研究表明，SDG 可提高TGF-β1 的诱导心肌细胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达，且JAK2/STAT3 信号通路抑制剂可逆转SDG 的作用，说明SDG 通过JAK2/STAT3 信号通路发挥作用。

综上，SDG 可改善TGF-β1 的诱导心肌细胞损伤，可抑制心肌细胞凋亡和氧化损伤，其机与激活JAK2/STAT3 信号通路有关，为SDG 治疗心肌损伤的临床应用提供了理论基础，为阐明SDG 的作用机制提供了参考，课题组将继续研究SDG 下游的具体靶向机制。