温度/超声双重响应型相变液滴对水凝胶结构性能的调控

赵 婵，刘 昊，陈洁莹，徐雪琴，胡 克，段 磊

南京医科大学生物医学工程系，江苏 南京 211166

相变液滴（phase-change droplet，PCD）是一种在微气泡研究基础上发展起来的具有液-气相变能力的诊疗一体化微纳材料［1］，相变液滴使用具有低溶解度和扩散率的全氟化碳（perfluorocarbon，PFC）作为核心［2］，使用白蛋白［3］、表面活性剂［4］、高分子聚合物［5］、脂质［6］等作为膜壳材料，在其膜壳内外可进一步装载药物、蛋白等活性物质或氧化铁、金等纳米材料，在外界温度、超声、磁场、激光等能量介导下，其内核PFC 可由液态转变为气态，从而引起相变液滴结构、尺寸、超声成像能力、释药能力等一系列的变化，赋予其“智能响应”能力。

水凝胶（hydrogel，Hy）是一类通过单体与亲水性基团的物理和化学交联，形成的三维网络结构聚合物［7］，可用于药物释放、组织工程和生物学研究等，是良好的生物医用材料［8］。智能响应型水凝胶可以通过单体与交联方式等的改变实现其对pH［9］和温度［10］等的响应，进而实现逆体积转变或凝胶-溶胶转变等。但目前制备智能响应型水凝胶，大多对原材料性能要求较高、成本高、制造工艺相对复杂，且无法控制水凝胶的孔隙数量与尺度、无法引入治疗性气体；与此同时，提高其对外界响应的灵敏度和精准度也是一大挑战。

相变液滴与水凝胶的结合，为水凝胶的智能调控赋予了新的思路，将相变液滴作为中间媒介，通过外部能量场对液滴相转变阈值的精准、联合调控，间接影响水凝胶的结构与性能。这种新思路的优点在于：一方面，相变液滴本身即是一种优良的诊疗一体化载体材料，在增强超声成像、药物/基因可控传递、高/低强度聚焦超声引导下的肿瘤消融等方面极具潜力，相变液滴的引入不仅能赋予水凝胶以上诸多新功能，还可通过对相变液滴的结构设计实现对外界刺激的快速、精确、多重响应；另一方面，这种通过间接响应达到智能调控的思路，降低了对水凝胶单体和制备工艺的要求，且可引入气体、可控制水凝胶的孔隙数量与尺寸，对其结构和力学性能的调控将更加精准。相变液滴与水凝胶复合材料的研究近年来仍然较少报道，主要的研究有：作为细胞培养或组织工程支架，调控细胞的生长迁移或生长因子的释放［11-12］；作为药物载体，进行局部药物递送等［13］。

基于以上思路，本研究以脂质作为膜壳材料，以全氟己烷（perfluorohexane，PFH）作为内核，制备出脂质相变液滴（lipid phase-change droplet，LPCD），探究其对温度或低强度聚焦超声（low intensity focused ultrasound，LIFU）的响应能力及相变前后的超声造影能力，并将其与光固化型水凝胶进行复合，构建脂质相变液滴-水凝胶复合材料（LPCD@Hy），研究温度或LIFU对LPCD@Hy结构、浮力、压缩和溶胀等力学性能的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（1，2-dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylcholine，DPPC）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基（distearoyl phosphatidylethanolamine polyethylene glycol carboxyl，DSPE-PEG-COOH）、全氟己烷（perfluorohexane，PFH）、聚乙二醇二丙烯酸酯［poly（ethylene glycol）diacrylate，PEGDA］和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺［N，N’-methylenebis（acrylamide），BIS］（上海阿拉丁控股集团有限公司）；胆固醇（cholesterol）（上海赛默飞世尔科技中国有限公司）；三氯甲烷和甲醇（上海国药集团化学试剂有限公司）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（江苏凯基生物技术股份有限公司）；苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（lithium phenyl-2，4，6-trimethylbenzoyl phosphonate，LAP）（江阴司特易生物技术有限公司）；细胞膜红色荧光探针（1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI）和细胞膜绿色荧光探针（3，3’-dioctadecyloxacarbocyanine，DiO）（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 LPCD的制备

采用薄膜水化法［14］制备LPCD，将DPPC、胆固醇和DSPE-PEG-COOH按照5∶1∶0.78质量比溶于有机溶剂中，溶剂由三氯甲烷和甲醇按照9∶1 的体积比配备而成，加入50 μL 1 mmol/L的DiI或DiO溶液（DiI 或DiO 染色LPCD）。40 ℃旋转蒸发仪（上海贤德实验仪器有限公司）旋转2 h 后，放入真空干燥箱中过夜，加入30 mL PBS 缓冲液旋转蒸发仪水化2 h。水化后加入300 μL PFH，使用超声波细胞破碎仪（南京先欧仪器制备有限公司）超声5 min，功率为130 W，得到LPCD。

1.2.2 LPCD的结构和粒径表征

使用光学显微镜（Life Technologies 公司，美国）和扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）（JEOL 公司，日本）观察LPCD 的形貌、大小及膜壳情况。使用粒度仪（Anton Paar 公司，奥地利）测定LPCD在常温下的粒径分布和zeta电位。

1.2.3 LPCD相变温度阈值的确定

使用粒度仪分别测定LPCD 在常温、56 ℃、60 ℃、66 ℃的粒径大小，分析其在核心PFH 相转变温度附近的粒径变化。并通过光学显微镜观察相转变前后的形貌变化。

1.2.4 超声对LPCD粒径的调控

制备与人体软组织声阻抗相似的体模，体模中有1个用于注入样品的孔洞，将样品注入体模后，使用低强度聚焦超声（low intensity focused ultrasound，LIFU）（深圳一粟医疗科技有限公司）经体模照射LPCD，观察LPCD液-气相变现象。超声探头距离样品约1 cm，超声频率为840 kHz，输出功率为7.3 W，脉冲重复周期为20 ms，脉冲持续时间为8 ms。在超声时间分别为0、10、15、20 min时，光学显微镜下观察LPCD的粒径和形貌的变化。

1.2.5 液-气相变对LPCD超声造影能力的影响

将相变前和相变后的LPCD 样品注入体模，使用小动物超声成像系统（Visual Sonics 公司，加拿大）进行成像，超声探头频率为18 MHz，增益为30 dB。并通过荧光显微镜（OLYMPUS 公司，日本）观察相转变前后的形貌变化。

1.2.6 LPCD@Hy的制备

将PEGDA、LAP、BIS按照摩尔比3.6∶1.7∶1放入LPCD溶液中，加入适量的DiI溶液对整个水凝胶染色（浮力实验），待完全溶解后，取160 μL 溶液于模具中，405 nm 蓝紫光固化15 s，得到LPCD@Hy。单纯水凝胶（Hy）的制备方法与LPCD@Hy 相似，只需将第一步中的LPCD溶液换成PBS即可。

1.2.7 温度对LPCD@Hy结构的调控

使用荧光显微镜、场发射SEM（FEI公司，美国）和小动物CT（苏州海斯菲德信息科技有限公司）观察25 ℃和65 ℃加热3 min后LPCD@Hy的内部结构。

SEM 样品制备：将25 ℃和65 ℃加热3 min 后的LPCD@Hy 放入西林瓶中冻干，撕成长条状，喷金，观察剖面的孔洞和网络结构。

小动物CT 成像参数：X 线管扫描条件设置为60 kV 和133 μA，单次曝光时间为50 ms，扫描分辨率为50 μm，扫描角度间隔0.5°。成像后对图像进行三维重建，得到LPCD@Hy的三维立体图。

1.2.8 超声对LPCD@Hy结构的调控

将LPCD@Hy放入盛有PBS的6孔板中，超声探头对准6 孔板，和PBS 的液面直接接触，探头距离LPCD@Hy 约2 cm，超声参数与1.2.4 相同。在超声时间分别为0、10、30、50、60 min 时，荧光显微镜下观察水凝胶中LPCD的粒径和形貌的变化。

1.2.9 温度/超声对LPCD@Hy浮力的调控将Hy 和LPCD@Hy 装入带有刻度封闭透明玻璃瓶中，65 ℃水浴加热，观察水凝胶的浮力变化，然后将加热后的水凝胶放入4 ℃冰箱，观察降温对水凝胶浮力的影响；用LIFU 照射Hy 和LPCD@Hy，步骤与1.2.6 相同，观察LIFU 对水凝胶中LPCD 的作用，及其引起的水凝胶内部结构和浮力的改变，最后用125 W超声初步评估水凝胶中LPCD 相变后形成的微气泡破碎所需超声参数。

1.2.10 液-气相变对LPCD@Hy机械性能的调控

压缩性能：将Hy 和LPCD@Hy 制备成直径约10 mm，高4 mm 的圆柱体。样品分为Hy 25 ℃组、Hy 65 ℃组、LPCD@Hy 25 ℃组、LPCD@Hy 65 ℃组。使用生物材料力学性能测试系统（MTS 公司，美国）进行压缩，压缩程度为85%，每个样品重复3次。

溶胀性能：通过称重法测量水凝胶的溶胀率，样品分为Hy 37 ℃组、Hy 65 ℃组、LPCD@Hy 37 ℃组、LPCD@Hy 65 ℃组。每隔一段时间取出水凝胶，用湿润的吸水纸擦去水凝胶表面的水，然后用天平称重，得到Wt，待水凝胶溶胀达到平衡后，取出水凝胶冻干，得到干凝胶的重量W0，计算水凝胶的溶胀率：溶胀率=（Wt-W0）/W0×100%。

2 结果

2.1 LPCD粒径和形貌表征

常温时（25 ℃）LPCD 的平均水动力尺寸为165.7 nm（图1A），zeta 电位为-7.8 mV（图1B），说明液-气相变前，LPCD 处于纳米尺度。这一尺度使其在光学显微镜下很难被观察到（图1C），进一步通过SEM 进行表征（图1D），可以清晰地观察到LPCD 的空壳结构，在SEM 拍摄过程中，由于电子束的作用使得相变液滴内核瞬间汽化，导致LPCD粒径增大，直至膜壳破裂，形成了大量直径在微米量级的空腔结构，这也一定程度上验证了LPCD 在外界刺激下的液-气相转变能力及相转变所引起的尺度变化情况。

图1 25 ℃时LPCD 的表征Figure 1 Characterization of LPCD at 25 ℃

2.2 温度/超声对LPCD粒径的调控

相变液滴的内核成分PFC 在环境温度超过其沸点或压力大于汽化阈值时，可以实现从液态到气态的转变。PFH 是一种常用的PFC，沸点为56 ℃，在37 ℃下相对稳定［15］，且在重复激活方面表现优异［16］，因此本研究使用PFH 作为LPCD 的液态核心。脂质膜壳的包裹通常会对PFH 的相转变能力产生影响，改变其发生相转变的阈值温度，通过对常温、56 ℃、60 ℃、66 ℃条件下，LPCD粒径和zeta电位的检测，明确了LPCD的相变温度。

图2A 为不同温度下LPCD 的粒径分布变化情况，可以看出当温度升高至PFH 的相变温度56 ℃时，LPCD 的平均水动力尺寸由165.7 nm 增加至344.1 nm，粒径分布出现了双峰，说明此时一部分相变液滴内核发生明显汽化，粒径增加明显形成了微米粒度峰，而另一部分相变液滴内核还未发生明显汽化，粒径稍许增加保持纳米粒度峰；当温度升至60 ℃时，LPCD的平均水动力尺寸增长至1 277.7 nm，粒径分布成为单峰，说明此时，绝大部分LPCD的内核均发生了明显液气相变，成为粒径为微米级的脂质微气泡；当温度继续升高至66 ℃时，LPCD的平均水动力尺寸继续增加为1 380.2 nm，而粒径分布又一次出现双峰趋势，这是因为随着温度的进一步升高，内核进一步汽化，导致部分微气泡继续长大甚至破裂，留下粒径较小的微气泡稳定存在，使原来的单峰分化为双峰。图2B 为不同温度下LPCD 的zeta电位变化情况，表明温度变化不会对其表面zeta电位造成太大影响。光学显微镜下观察，也直观地验证了以上粒径变化的结果（图2C）。以上结果表明，使LPCD 发生较完全相变的温度范围在60 ℃至65 ℃之间，此时LPCD 的粒径会由纳米尺度变化为微米尺度。

图2 温度对LPCD粒径的调控Figure 2 Regulation of temperature on particle size of LPCD

温度调控LPCD相变需要将温度升高到PFH的相变点56 ℃以上，这在体内应用时比较受限。压力的变化也能够引起液滴发生相变，称为声液滴汽化现象（acoustic droplet vaporization，ADV）。超声具有无创、无辐射、成本低等特点［17-18］，尤其是低强度聚焦超声，在临床上具有较高的应用安全性，可作为声液滴汽化的激励源。图3 为LIFU 照射0、10、15、20 min 时LPCD 的光学显微镜图。可以观察到超声照射15～20 min 时，部分LPCD 发生明显相变，粒径显著增加至微米量级。随着超声照射时间的延长，发生液-气相转变的LPCD 数量逐渐增多。以上实验结果表明，温度/超声调控下LPCD 的粒径均能够发生巨大变化，这赋予了LPCD良好的应用潜力。

图3 超声对LPCD粒径的调控Figure 3 Regulation of ultrasound on particle size of LPCD

2.3 液-气相变对LPCD超声造影能力的影响

内核液-气相变使得纳米级液滴变为微米级气泡，理论上可显著提高其超声造影能力，图4是相变前、后LPCD 的体外超声成像结果。可以看出无论是B-模式还是造影模式，发生相变之后LPCD 的超声图像灰度均高于相变之前（图4A），说明相变液滴液-气相转变能够增强超声成像效果。图4B为造影模式下，相变前、后LPCD的平均信号强度随时间变化曲线，可以看出，相变后LPCD的超声图像增强时间可持续4 min以上，在造影开始的1 min内信号强度最高，之后由于微气泡逐渐发生团聚、破裂等现象，导致超声造影能力逐渐减弱。图4B中也给出了LPCD 相变前后的荧光显微镜图片，可以观察出相变前后其形貌的明显变化。

图4 LPCD的体外超声成像图片Figure 4 Ultrasound images of LPCD in vitro

2.4 温度/超声对LPCD@Hy结构的调控

将LPCD与水凝胶复合后，分别对25 ℃与65 ℃加热3 min后的LPCD@Hy 结构进行表征，研究液滴相变对水凝胶结构的影响。图5 为加热前后，LPCD@Hy的宏观形貌、CT、荧光显微镜和扫描电镜观察结果。可以看出温控下液滴的相变形成的气泡，可以使水凝胶内部形成密集的孔洞，如图5A 中白色空泡和图5E中黄色亮点所示，由于水凝胶内部网络结构的限制，孔洞形状大部分呈梭形而非球形（图5G），直径在几十微米量级，尺寸大于水凝胶自身的空隙结构（图5H）。

图5 温度对LPCD@Hy结构的调控Figure 5 Regulation of temperature on the structure of LPCD@Hy

虽然温度能够通过调节LPCD相变调控水凝胶的内部结构，但超声是更为有效和实用的方法。前述实验已经证实LIFU 能够促使LPCD 在水溶液中发生相变，但液滴汽化的声压阈值与周围介质的硬度和黏度有关，因此，本文通过荧光显微镜观察，探究了不同照射时间下LPCD 在水凝胶中的相变情况，研究超声调控下液滴相变对水凝胶结构的影响。图6 为LIFU 照 射0、10、30、50、60 min 时LPCD@Hy 的荧光显微镜图。可以观察到，随着照射时间的增长，LPCD 在水凝胶中的相变程度不断增大，逐步形成大量百微米量级的气孔。与温度调控相比，超声调控可通过对照射时间和强度的调节，实现在特定的时间和空间位置，对水凝胶结构的更精准和连续调控。上述表征结果证实了相变液滴可以作为中间媒介，通过响应外部温度或超声变化，间接而明显地改变水凝胶的结构。为水凝胶在细胞培养、组织工程和药物递送等方面的应用提供了新思路。

图6 超声对LPCD@Hy结构的调控Figure 6 Regulation of ultrasound on the structure of LPCD@Hy

2.5 温度/超声对LPCD@Hy浮力的调控

理论上，LPCD@Hy 内部结构的变化会对其性能造成影响。图7A 直观地表明液滴相变会引起水凝胶浮力的显著变化，外部温度或超声能量的介导，均无法使未与相变液滴复合的水凝胶Hy浮力发生变化，而与相变液滴复合的水凝胶LPCD@Hy，65 ℃加热32～42 s即开始浮起并最终稳定漂浮于液面上，降温至4 ℃未明显改变水凝胶在水溶液中的位置，说明降温未对水凝胶的结构和浮力产生明显影响。同样，LPCD@Hy 在LIFU 照射50 min 时开始浮起，60 min 时能够稳定地漂浮在液面上。当增大超声功率至125 W照射15 min后，LPCD@Hy再次下沉至溶液底部，光学显微镜观察发现125 W 超声作用前后水凝胶的结构发生了明显变化，超声前水凝胶中存在的大量微米级气泡（图7B），超声作用后气泡消失（图7C），表明调节超声强度和作用时间，不仅可以使水凝胶中的LPCD 发生相变，还可以产生破裂。以上结果提示，与LPCD 的结合不仅可将气体成分引入水凝胶，还可通过对温度和超声的更细致调控，精准控制水凝胶在溶液或血液中的位置。

图7 LPCD@Hy温度/超声调控下的浮力变化Figure 7 Buoyancy variation of LPCD@Hy under temperature/ultrasound regulation

2.6 液-气相变对LPCD@Hy机械性能的影响

为了对比LPCD 液-气相变对水凝胶压缩性能和溶胀性能的改变，通过加热的方式使水凝胶中的LPCD 发生相转变，因为相比于超声，温度升高时水凝胶受热更均匀，LPCD 相转变更完全，水凝胶整体结构的改变更显著。首先，分析了液滴引入对水凝胶压缩性能的影响。图8A中的压缩应力-应变曲线表明，未复合相变液滴的水凝胶Hy，升温前后的应力曲线变化不大，说明升温对水凝胶自身的机械性能影响较小。而复合了相变液滴的水凝胶LPCD@Hy，与Hy相比表现出较低的压缩强度，这是因为液滴的加入使得水凝胶的内部有了新的结构单元，交联网络更加不规则，导致凝胶强度降低。另一方面，升温对LPCD@Hy 的压缩性能也会产生影响。65 ℃加热后，在压缩应变为60%时，压缩应力从21.06 kPa 上升到28.99 kPa，而最大压缩应变由71.22%降低到65.44%，这是因为相变液滴在此过程成为微气泡，原本的液态内核成为气态，使凝胶抗压能力增强；而微气泡进一步撑大了水凝胶的网络结构，增加了其结构的不规则度，使其增强硬度的同时降低了韧性。

水凝胶的溶胀率是评价水凝胶性能的重要指标，也在一定程度上影响水凝胶在各方面的应用。图8B中溶胀率随时间的变化曲线表明，未复合相变液滴的水凝胶Hy 升温后的溶胀速率和平衡溶胀率大于37 ℃升温前，说明升温使得水凝胶网络结构变得疏松，对溶胀产生较大影响。而复合了相变液滴的水凝胶LPCD@Hy，与Hy 相比，在37 ℃和65 ℃都表现出较低的溶胀率，这是因为LPCD 在水凝胶网络结构中起一定的支撑和空间占据的作用，导致37 ℃时水凝胶不容易发生溶胀；另一方面，65 ℃时LPCD 粒径变为微米级，在水凝胶网络结构中占据一定的空间，使得外环境的PBS 溶液无法进入水凝胶内部。这也说明LPCD的加入使得水凝胶的网络更加稳定，溶胀性能相对减小。通过4 条曲线的对比，可以发现水凝胶的溶胀率在温度较高时表现出一定的退溶胀性质，随后在不同的条件下均随时间逐渐增大至平台期。

图8 相变液滴-水凝胶复合材料的压缩和溶胀性能Figure 8 Compression and swelling properties of phase-change droplets-hydrogel composites

3 讨论

相变液滴与智能响应水凝胶均是近年来研究的热点，而将两者结合，设计能够响应外部多种激励的复合水凝胶的研究还鲜有报道。本研究制备了一种温度/超声双重响应型脂质相变液滴，并对其在温度/超声激励下的相转变能力，液-气相变前后的超声造影能力进行评估，同时，当其与水凝胶复合后，研究了温度/超声激励下，相变液滴对水凝胶的结构与性能的调控。

在温度和超声调控下，脂质相变液滴能够发生液-气相转变，由纳米级液滴蒸发形成微米级气泡。和温度产生的单纯热效应相比，超声能够通过空化作用、机械作用等综合效应刺激液滴发生相变［19］。相变液滴相转变后能够增强超声造影效果，主要是由于与纳米液滴相比，微米级气泡有更大的散射面积，内核气体也比液体有更大的声阻抗，从而可以有效反射声波。外部激励对相变液滴超声造影能力的调控，一定程度上解决了传统微气泡的应用弊端。外界激励前，PFC核心保持液态，相变液滴粒径处于纳米量级，在血管内有较好的循环稳定性［20］，且可以通过血管壁扩张进入病变组织，克服了传统微气泡由于微米尺度的限制易被网状内皮系统清除［21］，无法透过血管进入肿瘤组织内部，从而仅适用于血管造影的不足；外界能量激励之后，纳米液滴转化为微气泡，又克服了纳米尺度造影剂对超声信号的增强作用不足的弊端。

和水凝胶结合后，在温度和超声的调控下，相变液滴同样能够发生液-气相转变，在水凝胶内部形成大量孔洞，从而改变水凝胶内部的结构；同时，能够通过调节相变液滴的相变程度控制水凝胶浮力的变化。除此之外，液-气相转变会影响水凝胶的机械性能，相变液滴的引入会降低水凝胶的压缩强度，升温后，使水凝胶的硬度增加，韧性下降。本文研究了温度和超声场对相变液滴-水凝胶复合材料的调控，但在超声对水凝胶结构性能变化的更精准调控方面，还有待进一步深入。

综上所述，本研究制备了一种温度/超声双重响应型脂质相变液滴，可在温度/超声激励下实现液-气相转变，能有效提高相变液滴的超声造影能力，同时，当与水凝胶复合后，通过温度/超声激励，可以间接调控水凝胶的结构与性能。该研究目前尚处于初步阶段，后续将从以下几个方面深入：优化相变液滴的结构，构建适用于体内应用的低沸点相变液滴；对相变液滴进行精准调控，细化超声参数，并探索不同尺寸相变液滴液-气相变所需的超声强度阈值；研究水凝胶结构和力学性能的改变对药物释放、组织工程、细胞培养等应用的影响。