凤凰单丛茶果皮与种皮提取液的体外抑菌作用研究

李 刚，吴清韩，刘志聪，吴锐冰

（1.韩山师范学院 生命科学与食品工程学院，广东 潮州 521041；2.广东省粤东药食资源功能物质与治未病研究重点实验室，广东 潮州 521041）

茶树是山茶科山茶属灌木或乔木.蒴果圆球形，直径2.5-3厘米，2-3室，每室有种子1-2 个，果皮厚木质（图1A），果实成熟后裂开，种子（茶籽）脱落（图1B），种子外层木质状壳为种皮）（图1C）［1］.我国茶树栽培历史悠久，分布广泛，种质资源丰富［2］.凤凰单丛茶是广东省潮州市凤凰镇茶农经凤凰水仙选育而来的优异单株，以其单株（丛）采收、单株（丛）加工而得名［3］，文中简称凤凰茶.近年来，凤凰茶的经济效益带动了当地的经济发展，提高了人民的生活水平.但调查发现，当前凤凰茶茶农、茶叶生产企业对茶树的种植、茶叶加工、茶叶产品创新开发等方面关注较多，而茶树果实所具有的潜在经济效益却未得到关注及进一步开发利用.加之凤凰单丛茶主要沿习单株种植、单株采摘、单株制茶的传统制茶工艺，且凤凰茶树主要以异花传粉，茶农为了保证茶叶品质如初，凤凰茶树的繁殖方式主要以扦插代替有性繁殖，进一步导致茶果需求更为减少，茶树果实除极少数用于繁殖以外，其余大部分自然脱落，造成资源浪费.

图1 茶树果实及种子

目前关于茶树果实的利用偏向于油茶种子的综合利用［4］；樊兴土等研究了茶果的主要化学成分及其在成熟过程中的变化规律［5］；张卫明等研究了茶果粗脂肪与粗皂甙的积累，报道了茶果在成熟过程中粗皂甙及粗脂肪的积累情况［6］；郑德勇等研究发现，茶树果实中含有角鲨烯、甾醇、生育酚等微量的活性物质［7］；而关于凤凰茶茶果的研究较少.唐裕芳等发现，凤凰茶果含有大量多缩戊糖、鞣质、黄酮及黄酮苷类等成分，经加工后可利用于化工、医药、农业等行业［8］.因此凤凰茶树果实的综合开发利用具有一定的价值.

凤凰茶产业的顺利发展，离不开有机茶园的建设.但是茶园农药的不合理使用一直是困扰有机茶园建设的一个问题.茶作为重要植物资源，茶叶的抑菌作用已经广为人知，因此本研究以茶树果皮和种皮为研究对象，研究其抑菌效果，为茶树果皮和种皮的综合应用，为开发新型杀菌剂建设生态茶园具有重要意义.

本实验通过研究凤凰单丛茶果皮与种皮体外抑菌作用，分析其醇提取液对大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制效果，以此来弥补凤凰单丛茶的研究空缺，使茶果变废为宝，为植物源除草剂的开发及茶果的综合利用及生态茶园建设提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料：凤凰茶果，采自广东省潮州市凤凰山，洗净后人工剥离果皮与种皮，55 ℃烘干备用.

供试菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌由韩山师范学院微生物实验室提供.

培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基.

试剂：氯化钠、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯，牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉均为生物化学试剂，以上试剂由韩山师范学院植物研究所提供.

仪器：旋转蒸发仪，高压蒸汽灭菌锅，单人单面超净工作台，培养箱，烘箱，pH 试纸，玻璃棒，漏斗，烧杯，培养皿，滤膜过滤器等.

1.2 方法

1.2.1 凤凰茶果皮与种皮醇提取液的制备及其浓度的确定

分别称取凤凰茶果皮20.15 g，种皮20.18 g，剪碎后研磨，各加入150 mL 70%乙醇溶液，浸泡过夜（10 h-12 h），滤过液4 ℃冰箱保存，滤渣分别用150 mL 蒸馏水浸泡过夜（10 h-12 h），滤出液与之前相应醇提取液混合，用旋转蒸发仪浓缩至10 mL，分别制得凤凰茶果皮和种皮醇提取液.将提取液置4℃保存待用.滤渣烘干称重，然后分别计算醇提取液的浓度［9］.

计算公式：提取液浓度（g/L）=［原材料质量（g）-滤渣质量（g）］/浓缩液体积（L）.

1.2.2 培养基制备

牛肉膏蛋白胨固体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基按照《微生物试验手册》制备［10］.

1.2.3 菌悬液的制备

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3 种供试细菌菌种分别接于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，37 ℃恒温培养24 h 后，分别挑取3 种供试细菌单克隆菌落各接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基（30 mL）中，置37 ℃恒温摇床培养12 h得到相应细菌培养液［11］.

1.2.4 抑菌实验

抑菌圈大小测定：牛津杯法.吸取100 μL供试细菌液加于无菌牛肉膏蛋白胨固体培养基中，涂布棒涂布均匀.取无菌牛津杯垂直置于培养基上，轻轻按压，使牛津杯与培养基结合紧密，每皿4 个.将凤凰茶果皮与种皮醇提取液分别用无菌水按三倍稀释法稀释成相应浓度的溶液，醇溶液做为对照.分别加200 μL 凤凰茶果皮与种皮提取液于牛津杯中，每个培养皿中滴加一种浓度的凤凰茶果皮或种皮醇提取液，每组3 个重复实验.平板在室温下放置20 min 后置于37 ℃恒温培养12 h，取出测定抑菌圈直径大小，计算三次重复实验的平均值，抑菌圈平均直径≤6 mm（牛津杯直径），则对应浓度已无抑菌效果，据此比较各浓度的抑菌效果［12-14］.

最低抑菌浓度（MIC50）测定：采用平板稀释法，将凤凰茶果皮与种皮醇提取液分别用无菌水按三倍稀释法稀释成相应浓度的溶液，加各浓度的提取液0.5 mL于牛肉膏蛋白胨平板培养基中，各平板加入待测菌液0.2 mL，涂布均匀，37 ℃倒置培养36 h后统计菌落数，重复3次.以只加菌悬液为对照组.根据平板菌落数计算抑菌率.

抑菌率＝（对照皿菌落数－试验皿菌落数）/对照皿菌落数×100%，以抑菌率50%提取液浓度计算MIC50结果［15-16］.用统计软件分析数据显著性差异.

1.3 数据与统计

数据统计使用SPSS11.5软件，对抑菌试验结果进行方差分析，不同试验菌及不同浓度提取液之间的差异显著性均采用LSD法进行多重比较.绘图使用office 2007.

2 结果与分析

2.1 凤凰茶果皮与种皮提取液浓度

取同质量的果皮与种皮，经醇提、浓缩后，发现种皮滤渣质量明显高于果皮，表明果皮中有更多的次生物质被提取.获得的果皮与种皮的提取液浓度有明显差异，果皮提取液的浓度（456.89 g/L）明显高于种皮提取液（249.10 g/L）（表1）.

表1 凤凰茶果皮与种皮提取液浓度

2.2 抑菌圈的测定结果与分析

采用牛津杯法测定了凤凰茶果皮与种皮提取液的抑菌效果，结果发现：凤凰茶果皮提取液对3 种供试细菌均有抑制作用（最小有效抑菌浓度为5.64 g/L），且抑菌作用随提取液浓度的增加而显著增强.果皮提取液对3 种供试细菌的抑菌效果依次为金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌.当果皮醇提取液浓度在456.89 g/L 时，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别达22.67 mm、18.33 mm、15.00 mm，抑菌效果明显；当提取液浓度为5.64 g/L时，对金黄色葡萄球菌仍有抑菌效果.

与果皮提取液相似，凤凰茶种皮提取液对3 种供试细菌也有明显抑制作用，且抑菌作用随提取液浓度的增加而显著增强.种皮提取液对3 种供试细菌的抑菌效果依次为金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌，与凤凰茶果皮提取液相同.种皮提取液浓度在249.10 g/L 时，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别达25.00 mm、24.67 mm、17.33 mm，具有很强的抑菌效果.虽然种皮提取液在高浓度的抑菌作用明显，但其最小有效抑菌浓度为27.68 g/L，而果皮提取液为5.64 g/L，其抑菌作用弱于果皮提取液（图2）.

图2 凤凰茶种皮提取液（A）和果皮提取液（B）对供试细菌的抑菌圈直径

2.3 最低抑菌浓度（MIC50）的测定

采用三倍稀释法测定了凤凰茶果皮与种皮提取液对3种细菌的最低抑菌浓度（MIC50），结果表明，凤凰茶果皮和种皮提取液对金黄色葡萄球菌的MIC50分别为5.64 g/L和9.23 g/L，对大肠杆菌的MIC50分别为5.64 g/L和9.23 g/L，对枯草芽孢杆菌的MIC50为16.92 g/L和27.68 g/L.总体分析，凤凰茶果皮提取液的抑菌作用要强于种皮提取液.两种提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有明显抑菌作用，且抑菌效果相似，分别为对金黄色葡萄球菌最强，大肠杆菌次之，其次为枯草芽孢杆菌（表2）.

表2 凤凰茶果皮提取液及种皮提取液对供试细菌的MIC50

3 讨论

研究结果发现凤凰茶果皮及种皮对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有明显的抑菌效果，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于枯草芽孢杆菌.本文探讨的凤凰茶果皮及种皮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用为凤凰单丛茶茶果的抑菌价值提供了依据，为凤凰茶果皮和种皮的综合利用开发提供了思路.基于这样的抗菌理念，可以赋予凤凰茶茶果新的利用价值，凤凰茶果在潮汕地区资源丰富，若能以其为原料进行植物源抗菌剂的开发，可广泛用于食品、医药等行业，也可以作为植物源杀菌剂用于有机茶园的管理，将为凤凰茶的综合开发利用开拓广阔的前景.

本实验将凤凰茶果果皮与种皮分开作为材料，旨在探究凤凰茶果果皮与种皮抑菌作用的区别及有效成分的差异，凤凰茶果果皮与种皮均具有明显的抑菌作用，但二者又有所不同，茶果果皮的抑菌效果要强于种皮，为了深入研究其抑菌效果，后续工作准备对提取液进行成分分离，并对有抑菌活性的物质进行结构分析和鉴定，阐明其抑菌机制，进一步为凤凰茶的综合利用提供理论依据.