不同给药途径下葛根素对坐骨神经分支选择性损伤小鼠机械痛阈及促炎症因子表达的影响

张倩，徐静，陆培春，夏琳，孙彩霞

神经病理性疼痛(NP)是躯体感觉神经系统疾病或受损导致的一种疼痛[1]，且通常是持续存在或反复发作的慢性疼痛。流行病学调查显示，在美国和欧洲，慢性疼痛发病率最高可达40%[2-3]，而我国至少有3亿的慢性疼痛患者，其中慢性NP在普通人群中发病率为6.9%～10%，住院患者中可达16%，是造成全球疾病负担的主要因素之一[4-5]。葛根素是从我国传统药、食同源植物——葛根中提取的异黄酮类衍生物，具有吸收快速、分布广泛、所需剂量小、不良反应小等优势，因其具有抗炎、抗氧化、控制血糖、抗肿瘤等作用，被广泛用于心脑血管疾病、糖尿病及其并发症、Alzheimer’s症、癌症等多种疾病的治疗[6]。然而，葛根素虽具有广泛的药理活性，但其临床应用方式却十分有限。国家食品药品监督管理局数据库[7]显示，葛根素目前仅限于静脉注射和滴眼两种临床给药方式。近年来有研究[8-10]发现葛根素对中枢及周围性NP有缓解作用，但其作用机制尚不完全清楚。本次研究通过建立创伤小、实验重复性好，能更好模拟临床NP症状的坐骨神经分支选择性损伤(SNI)小鼠模型[11]，并进行动物行为学及分子生物学测试，比较三种不同给药途径下葛根素对SNI小鼠机械痛阈及促炎症因子表达的影响，旨在探寻NP治疗中更合适的葛根素给药方式。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性6～8周BALB/c小鼠，SPF级，体重20～25 g ,由江苏大学实验动物中心提供并饲养[许可证号：SYXK(苏)2018-0053], 小鼠适应环境5 d后开始建模，保持饲养环境相对安静，室温(22±2)℃, 空气相对湿度30%～40%, 12 h/12 h昼夜节律, 自由摄食水。本实验通过江苏大学动物实验中心伦理审查，实验过程遵守实验动物福利伦理原则。

1.1.2 主要试剂及仪器 注射用葛根素购自瑞阳制药有限公司。Trizol购自Invitrogen，异戊醇、氯仿等试剂及β-Actin 、IL-1β、IL-6、TNF-α引物均购自上海生物工程有限公司，PrimescriptTMRT reagent Kit、SybrGreen qPCR mastermix 购自TaKaRa公司，NC12775-99 von Frey 痛觉测试包购自Stoelting 公司，微量分光光度计购自TitertekBerthold，Mycyler PCR仪购自BIO-RAD 公司，Quantstudio 5荧光定量PCR仪购自ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 SNI小鼠模型制备[11]1%戊巴比妥按0.5 mg/10 g腹腔注射麻醉小鼠，给药5～10 min后，可达麻醉深度，对左后肢进行备皮，以碘伏消毒皮肤，沿左侧坐骨神经分叉处切开皮肤，分离筋膜和股二头肌，暴露坐骨神经及其三个分支：腓总神经、胫神经和腓肠神经；用4-0的慕思线将胫神经和腓总神经分别结扎、沿远端切断，并去除其末端2～4 mm的神经；保留腓肠神经，逐层缝合。

1.2.2 实验动物分组及处理 建模前5 d，每天检测小鼠的50%机械缩足反应阈值(MWT)，确定小鼠的基础阈值，剔除痛阈异常小鼠。按随机数字法，将建模组小鼠分为五组，分别是建模无治疗组(SNI组)、建模5 d腹腔注射葛根素组(SNI-PA组)、建模5 d鞘内注射葛根素组(SNI-PI组)、建模前5 d予以鞘内置管[12]并于建模5 d经导管注射葛根素组(SNI-PC组)、建模5 d鞘内注射生理盐水组(SNI-NS组)。对照组小鼠随机分为三组，即正常对照组(CON组)、正常鼠鞘内注射生理盐水组(CON-NS组)、正常鼠鞘内注射葛根素组(CON-PI组)。于SNI模型建立5 d，确认痛阈明显降低后，当天即予以药物处理，后于每天9：00至12：00给药一次，持续给药至建模15 d，每次予鞘内注射5 μl葛根素，即葛根素浓度为4 μg/μl；腹腔注射0.5 ml葛根素，即葛根素的治疗剂量为100 mg/kg。生理盐水组与SNI-PI组注射时间、剂量相同。排除小鼠SNI建模失败、建模后小鼠出现自噬、伤口感染或左下肢完全瘫痪等影响痛阈测量、置管后利多卡因实验阴性(置管失败)、鞘内注射或置管后偏瘫甚至死亡等因素，最终保持各组小鼠的数量均为5只。

1.2.3 检测指标 (1)行为学观察：给药后2 d每天观察小鼠因建模所致的左足五趾收拢外翻畸形有无变化。(2)给药后测量CON组、SNI组、SNI-NS组、SNI-PC组、SNI-PI组、SNI-PA组小鼠左足机械痛阈，计算50%MWT。每次测定选择当天9：00至12：00，室温23 ℃，在安静的环境下，将小鼠置于底为3 mm×3 mm的金属丝网的透明有机玻璃箱中，适应15 min，从中等力度的纤毛(0.16 g)开始测试，根据小鼠是否出现抬足或舔足表现，按照“up and down”方法，分别以上一级力度或下一级力度的von-Frey纤毛垂直刺激小鼠左足底皮肤，避开足垫，所用纤毛折力分别为0.008、0.02、0.04、0.07、0.16、0.6、1.0、1.4、2.0 g。每次刺激间隔至少30 s，最大折力为2.0 g，超过此值时记为2.0 g，根据刺激的纤毛力度及小鼠的缩足反射推算50% MWT，所有测量均由同一人完成。(3)腰段患侧脊髓背角促炎症因子检测：分别提取CON组、建模7 d SNI组、给药7 d SNI-NS组、SNI-PC组、SNI-PI组、CON-NS组、CON-PI组小鼠患侧脊髓背角，通过RT-qPCR检测促炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA含量变化。涉及引物序列：IL-1β sense 5′-GAA ATG CCA CCT TTT GAC AGT G-3′、IL-1β anti-sense 5′-CTG GAT GCT CTC ATC AGG CA-3′、IL-6 sense 5′-GAG TCC TTC AGA AGA TAC AGA AAC-3′、IL-6 anti-sense 5′TGG TCT TGG TCC TTA GCC AC-3′、TNF-αsense 5′-CCC TCA CAC TCA GAT CAT CTT CT-3′、TNF-α anti-sense 5′-GCT ACG ACG TGG GCT ACA G-3′、β-actin sense 5′-GCC AAC CGT GAA AAG ATG ACC-3′、β-actin anti-sense 5′-GAG GCA TAC AGG GAC AGC AC-3′。

2 结 果

2.1 行为学观察结果 所有SNI建模组小鼠于建模3 d即可见明显的左足畸形，表现为五趾并拢屈曲、轻度外翻，行走时以右足为主，左足不敢着地或轻靠在地，间或出现缩足或舔足行为。与CON组小鼠相比，SNI建模组小鼠行为差别明显。建模组中SNI-PC组、SNI-PI组小鼠建模后左足不敢落地或以右足为主行走且多次舔足现象于给药后明显好转，左足可以着地行走，且舔足次数减少，但五趾并拢内收，轻度外翻屈曲现象无明显改善。SNI-PA组、SNI-NS组与SNI组相比无明显改善。

2.2 50%MWT计算结果

2.2.1 CON组及各建模组之间比较 建模前，CON组、SNI组、SNI-PA组、SNI-PI组、SNI-PC组、SNI-NS组基础50%MWT分别为(1.27±0.10)g、(1.24±0.12)g、(1.26±0.08)g、(1.22±0.07)g、(1.26±0.13)g、(1.24±0.13)g，各组间差异无统计学意义。建模5 d，SNI-PA组、SNI-PI组、SNI-PC组、SNI-NS组50%MWT分别为(0.08+0.01)g、(0.08+0.01)g、(0.08±0.01)g、(0.08±0.01)g，与SNI组[(0.07+0.01)g]相比差异均无统计学意义(均P>0.05)，较CON组[(1.26+0.06)g]均明显下降(P<0.01)，提示SNI建模成功。

2.2.2 CON组、SNI组、SNI-PA组之间比较 给药3 d，SNI-PA组[(0.05+0.02)g]与CON组[(1.20+0.04)g]相比仍明显下降(P<0.01)，较SNI组[(0.03+0.01)g]差异无明显统计学意义(P>0.05)。推断腹腔注射葛根素对SNI小鼠痛阈改善无明显作用，遂未再针对SNI-PA组进行后续实验。

2.2.3 CON组、SNI组、SNI-PC组、SNI-PI组比较 SNI-PC组、SNI-PI组给药3 d(建模7 d)痛敏反应减弱，50%MWT分别为(0.34±0.11)g、(0.34±0.06)g，与给药前及同时间点SNI组小鼠[(0.03±0.01)g]相比,差异有统计学意义(均P<0.05)；给药7 d(建模11 d)，两组50%MWT均上升至峰值，SNI-PC组为(0.71±0.04)g，SNI-PI组(0.69±0.07)g，与给药前及同时间点SNI组小鼠[(0.02±0.01)g]相比差异有统计学意义(均P<0.01)；直至给药11 d(建模15 d)，两组50%MWT趋于稳定，但均未恢复到建模前及相应同时间点CON组水平。SNI-PC组与SNI-PI组两种不同的中枢给药方式效果相似，各时间点50%MWT差异无统计学意义(P>0.05),见图1。

注：SNI-PC组、SNI-PI组给药后与给药前比较#P<0.05，##P<0.01；与同时间点SNI组比较××P<0.01图1 CON组、SNI组、SNI-PC组、SNI-PI组小鼠患足50%MWT变化趋势及比较

2.2.4 SNI-PI组、SNI组、SNI-NS组比较 给药3 d，SNI-PI组50%MWT为(0.34±0.06)g，SNI-NS组为(0.05±0.01)g，SNI-PI组较SNI-NS组明显上升(P<0.01)；SNI-NS组50%MWT在鞘内注射生理盐水后较注射前进一步下降，且与同时间点SNI组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 腰段脊髓背角促炎症因子表达变化

2.3.1 SNI-PI组IL1-β、IL-6、TNF-α mRNA表达变化 见表1。根据图1中小鼠左足50%MWT变化趋势，SNI组建模7 d痛阈下降至最低，并保持在低谷水平；葛根素给药7 d后，痛阈上升至高峰期，并维持在高峰水平，分别选择CON组、建模7 d SNI组(SNI 7)、葛根素鞘内注射7 d SNI-PI组(SNI-PI 7)检测促炎症因子的表达情况。IL1-β、IL-6、TNF-α在SNI 7组均较CON组有不同程度上升(均P<0.05)，而SNI-PI 7组又较SNI 7组进一步升高(均P<0.05)。

2.3.2 SNI-PC组IL1-β、IL-6、TNF-α的mRNA表达变化 见表1。比较CON组、SNI 7组、鞘内置管葛根素治疗7 d SNI-PC组(SNI-PC 7组)促炎症因子的表达发现，SNI-PC 7组三种促炎症因子较SNI 7组均有不同程度的下降(均P<0.05)，但仍高于CON组水平(均P<0.05)。

2.3.3 CON组、CON-NS组、CON-PI组IL1-β、IL-6、TNF-α的mRNA表达比较 见表1。对CON组、鞘内注射生理盐水7 d CON-NS组(CON-NS 7组)、鞘内注射葛根素7 d CON-PI组(CON-PI 7组)促炎症因子比较发现，CON-NS 7组较CON组均明显升高(均P<0.05)，CON-PI 7组各促炎症因子较CON组亦明显升高(均P<0.05)，但较CON-NS 7组明显降低(均P<0.05)。

表1 腰段脊髓背角促炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量的比较(x±s,n=3)组别IL-1βIL-6TNF-αCON组1.01±0.121.01±0.141.02±0.26SNI 7组3.67±0.24▲4.36±0.39▲4.01±0.82▲SNI-PI 7组5.00±0.35#5.86±0.45#7.82±1.19#SNI-PC 7组1.84±0.42#2.23±0.42#2.51±0.39#CON-PI 7组3.04±0.36*3.08±0.42*3.42±1.11*CON-NS 7组6.09±1.115.42±1.246.05±0.85 注:与SNI 7组比较#P<0.05;与CON-NS组比较*P<0.05;与CON组比较▲P<0.05

3 讨 论

有文献[9]表明，葛根素经鞘内置管给药可能通过抑制脊髓细胞外信号调节激酶(ERK)及伴随的小胶质细胞激活缓解腰椎间盘突出引起的神经根性疼痛；亦有发现腹腔注射葛根素可以通过抑制背根神经节中瞬时感受器电位香草素亚型1(TRPV1)和瞬时感受器电位锚蛋白亚型1(TRPA1)的上调缓解坐骨神经部分结扎模型大鼠的痛觉过敏[10]，还可通过降低背根神经节或交感神经节中嘌呤能离子通道型P2X3受体表达来抑制伤害性感受信号的传递[13-14]，并在脊髓急性损伤模型中对神经具有保护作用[15]。这些研究结果提示葛根素通过腹腔注射、鞘内注射及鞘内置管等外周或中枢途径给药，均对NP有缓解作用，但目前尚无评价这三种给药方式对NP小鼠的影响。

本次实验使用经典的小鼠SNI模型，通过对各组小鼠机械痛阈的检测发现，腹腔注射葛根素并未对建模后小鼠机械痛阈产生明显影响。这与既往研究发现不符，结合其他研究中单次腹腔注射100 mg/kg葛根素于SNI小鼠的镇痛效应仅维持在给药后10～20 min[16]；在连续腹腔注射葛根素5 d停止注射后次日，炎性疼痛模型小鼠痛觉过敏和痛觉超敏再次出现[17]，提示葛根素消除半衰期短，需要频繁或大剂量注射[7]。本实验于注药次日再次给药前测量机械痛阈观察葛根素的慢性效应，效果并不理想，若想提高外周用药的慢性效能，需针对腹腔注射剂量及给药频率行进一步细化研究。另外，要考虑葛根素外周给药途径用于NP治疗的主要限制因素是其血-脑屏障通透性较低。研究[17]表明，腹腔给药90 min后体内葛根素浓度在肝、肾中较高，大脑中较低，提示外周给药后葛根素作用更多的是在外周而不是中枢；且葛根素虽可通过血-脑屏障，但脑靶向指数仅有5.0%，而联合应用冰片或α-细辛脑可以使葛根素更容易穿透血-脑屏障，明显改善其脑内的吸收速率和分布水平[7,18-19]。这也为进一步研发脑生物利用度更高的应用剂型，从而推进葛根素在外周途径镇痛的临床应用提供了新的线索。

鞘内注射与鞘内置管给予葛根素均可明显改善小鼠机械痛阈，表明葛根素通过中枢途径给药对NP有缓解作用。建模7 d，SNI小鼠患足痛阈下降至最低，出现明显痛觉超敏及痛觉过敏，同时腰段脊髓促炎症因子IL1-β、IL-6、TNF-α表达较正常小鼠明显升高，与既往研究[20]相符。但反复鞘内注射葛根素后，促炎症因子表达进一步升高，提示反复鞘内注射给药有致无菌性炎症风险。该观点在正常小鼠鞘内分别注射葛根素与生理盐水进行比较的实验结果中也再次得到证实。而与反复鞘内注射相比，鞘内置管给药能够在改善SNI所致的机械痛阈下降、缓解痛觉敏化症状的同时，明显减少腰段脊髓促炎症因子的表达。近年来，诸多研究已证实外周及CNS的炎症和免疫机制在NP发生、发展中的重要作用。神经损伤后，周围神经附近或神经内大量不同类型的免疫细胞浸润并被激活，其释放的促炎症因子直接或间接作用于外周及中枢痛觉敏化过程，其中TNF-α和IL-6可以通过脊髓谷氨酸受体提高兴奋性电流，IL-1β可以促进兴奋性突触传递、降低抑制性电流，还可以直接作用于外周TRPV1 受体[1,20-21]。结合之前提到，葛根素可通过抑制背根神经节中TRPV1、TRPA1及P2X3受体表达干预外周敏化[10,14]，初步推测鞘内给予葛根素后SNI模型鼠机械痛阈上调可能与其抑制腰段脊髓促炎症因子的表达，从而干预了促炎症因子在NP发生、发展过程中的相应环节有关，但其相关性及具体机制还有待进一步验证和探索。

综上所述，外周给予葛根素对SNI模型机械痛阈无明显改善，鞘内置管给药方式是发挥葛根素对NP治疗作用的有效途径，葛根素通过中枢途径发挥镇痛作用，可能与其抑制脊髓促炎症因子的表达有关。