二代测序技术在社区获得性鹦鹉热衣原体肺炎诊断中的应用价值

张连霞 于世杰 康千宽 赵慧霞 曹鄂洪

鹦鹉热衣原体肺炎为人畜共患疾病,在多数欧美国家、日本及我国香港等地该疾病已被列入法定传染病进行监管。鹦鹉热衣原体肺炎常表现为高热(＞39.1℃),伴全身酸痛不适,同时有咳嗽咳痰等症状,胸部CT以单侧或双侧肺叶实变为主,可伴有胸腔积液［1］。目前尚无可靠的流行病学资料。因为鹦鹉热衣原体为胞内微生物,常规痰涂片、培养以及血清学检验中可能会出现误诊和漏诊的情况,因此会延误治疗时机,影响患者的康复。二代测序技术能够对病原微生物基因片段进行信息获取获得病原体的遗传信息,且具有高度敏感性。与此同时能够针对常规检测不敏感的病菌微生物进行证据获取。本实验选取4 例社区获得性鹦鹉热衣原体肺炎患者作为研究对象,进一步探讨二代测序技术的诊断优势。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年12 月1 日～2020 年12 月1 日在南京同仁医院住院的4 例社区获得性鹦鹉热衣原体肺炎患者作为研究对象,年龄52～66岁,中位年龄58 岁；其中男0 例,女4 例。临床主要表现为早期以呼吸系统症状起病,但均为高热(＞39.1℃),伴全身酸痛不适,同时有咳嗽咳痰等症状,可伴有胸腔积液。本研究由南京同仁医院伦理委员会批准。患者均已签署知情同意书。

1.2 方法 4 例患者均进行二代测序技术检测。

1.2.1 标本采集 患者入院后均完善常规检查及电子支气管镜术前准备(凝血功能、血气分析、心电图等),完善痰液培养及呼吸道8项(含衣原体IgM抗体)检测；需要告知患者进行支气管镜检查的风险性以及必要性,同时介绍相关费用,由患者同意后执行。此外在术中需要全面监测患者的生命体征,并使用1%利多卡因先雾化后喷雾行咽喉部表面麻醉。在实施竞选前需要充分吸氧,随后实施肺泡灌洗,留取经支气管肺泡灌洗液(BALF) 5～10 ml。

1.2.2 标本保存和转运 将5 ml BALF冷藏在4℃下进行保存,并在24 h 内进行检验。

1.2.3 标本处理和DNA 提取 取受试者3 ml(体积)样本,首先经过15000g、4℃、10 min 获取样本富集液；取200μl 通过磁珠法(MAGEN Guangzhou,CHINA)进行DNA 提取与纯化；根据建库试剂盒Nextera XT(illumina,USA)说明书构建宏基因组文库(文库大小：～300 bp)；经Aglient 2100进行文库分析,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术(Bio-Rad CFX96,USA)精准定量；将加有不同index 接头序列的文库等量混合,应用illumina nextseq 550 DX测序平台完成高通量测序(测序策略：SE75)。

1.3 观察指标 分析患者的临床特点及检验结果、临床治疗方案和疗效。

2 结果

2.1 患者的临床特点分析 4 例患者均为52～66 岁的老年家庭妇女,典型表现(高热、咳嗽)、衣原体抗体IgM 检测结果及痰培养均为阴性；胸部CT 以单侧肺叶实变为主。见表1。

表1 患者的临床特点

2.2 检验结果 4 例患者的ALF 二代测序结果均于2 d后回报,可见鹦鹉热衣原体种属基因检出的序列数为1～61 个,中位检出序列数为24 个；二代测序技术阳性检出率为75.00%(3/4)。

2.3 治疗方案及疗效 对4例患者的治疗方案均进行调整,其中病例1 通过莫西沙星联合亚胺培南西司他丁抗感染治疗临床显示无效,仍反复发热,后调整为多西环素治疗好转；病例2 经莫西沙星治疗,病例3 通过甲磺酸左氧氟沙星联合哌拉西林钠他唑巴坦抗感染治疗后患者仍反复发热,且出现皮疹,调整为阿奇霉素联合亚胺培南西司他丁抗感染治疗均好转；病例4 给予头孢唑肟联合莫西沙星抗感染治疗仍有反复发热,调整为口服米诺环素后好转。

3 讨论

鹦鹉热衣原体主要宿主为鹦鹉、鸽子等鸟类,带菌或发病的家禽及外观健康但排菌的观赏鸟类是重要的传染源。禽类养殖场、宰杀、销售、转运乃至调教基地等均可能是传染场所。吸入受鹦鹉热衣原体污染的气溶胶可引起发病,但甚是罕见［2,3］。国外相关文献报道,鹦鹉热衣原体肺炎约占社区获得性肺炎的1%［4］,但因确诊困难,目前无可靠的流行病学资料。本次研究患者均为52～66 岁的家庭主妇,有可疑接触禽类市场,为病原菌的可疑来源。

本次研究中4 例患者的特点分析：①早期表现以呼吸系统症状起病,但均为高热(＞39.1℃),伴全身酸痛不适,不同于支原体肺炎以中等度发热为主；②病例1 伴明显心悸,病例1 和3 均伴有腰痛。有报道部分临床症状可表现为腹泻、心律失常、心肌炎、皮疹、脑炎、肝炎等［5-7］；③病例1、病例3、病例4 均伴有转氨酶异常,其中病例3 病程中出现皮疹；④胸部CT 以单侧或双侧肺叶实变为主,可伴有胸腔积液。

我国衣原体的检测方法包括病原学、血清学、分子生物学检测［8］。病原学检测是确诊方法,但阳性率低(20%左右)、耗时长及技术、设备要求高。在实际工作中,微量免疫荧光法(MIF)是国际上最常用的衣原体诊断方法［9］。本次研究中4 例患者均行常规痰液培养阴性,衣原体抗体IgM 检测阴性,均经BALF 送检二代测序技术明确诊断。

宏基因组新一代测序技术(metagenomics next generation sequencing,mNGS)可直接对被检测样本中的核酸进行高通量测序,通过与数据库对比,从而判断被检样本所包含的病原微生物种类［10］。本研究结果显示,二代测序技术对社区获得性鹦鹉热衣原体的诊断可行。目前针对二代测序技术检测病原体的结果判定还尚无统一标准,Somasekar 等定义mNGS 的结果判读标准,针对细菌、真菌、寄生虫每百万映射读取的Reads(rpm)＞阴性对照的10 倍,针对病毒Reads＞20 倍且覆盖度＞2%。与本研究病例结果不十分一致,这也反映出应结合临床判读二代测序结果。本研究中的不足之处在于mNGS 阳性的结果未进行聚合酶链式反应(PCR)验证。另外,由于目前耐药基因库尚未完善,二代测序技术对微生物耐药性的检测作用有限,需临床医生根据当地细菌药敏试验的大数据指导临床用药。目前鹦鹉热衣原体肺炎抗菌首选四环素类药物。有一项体外药敏试验结果提示莫西沙星对衣原体具有较强的抗菌活性［11］。国外仅有个案报道提示喹诺酮类药物治疗有效［12］。本次研究中病例1 通过莫西沙星联合亚胺培南西司他丁抗感染治疗临床显示无效,仍反复发热,后调整为四环素口服好转；病例2 采用莫西沙星、病例3 通过阿奇霉素抗感染治疗均好转；病例4 给予头孢唑肟联合莫西沙星抗感染治疗仍有反复发热,调整为口服米诺环素后好转。近年在我国已有报道衣原体属中的沙眼衣原体对四环素类药物耐药性明显增高,今后应进一步针对耐药基因库的建立及鹦鹉热衣原体亚单位疫苗研发。

综上所述,二代测序技术诊断社区获得性鹦鹉热衣原体肺炎,其方法更快速、准确、全面,可作为社区获得性鹦鹉热衣原体肺炎的诊断方法之一。