瑞芬太尼预处理对急性脑缺血损伤大鼠的保护作用探究

周金凤，曾宪晶，刘姝，袁金华，龙菲

井冈山大学附属医院，江西 吉安 343000

缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICD）是一类因脑局部血液循环中断引起的神经功能障碍性疾病，具有高发病率、高病死率、高致残率的特点。随着我国人口老龄化加快，脑血管疾病已经成为致死、致残的主要疾病之一，其中缺血性脑卒中最为突出，约占脑血管疾病的70%［1］。目前对ICD 尚缺乏有效的防治手段，给患病家庭带来沉重的医疗负担。研究表明：脑缺血缺氧发生后，细胞炎性因子参与启动脑缺血损伤炎症反应程序，炎性反应在急性脑缺血损伤过程中扮演重要角色，并可影响患者预后［2］。因此，早期积极有效干预缺血损伤所致的炎症级联反应程序的启动是防治脑损伤加剧的重要环节。

在探究脑损伤治疗过程中，通过药物预处理干预手段来诱导脑缺血耐受被证明是一种能有效减轻脑损伤的方法［3］。瑞芬太尼作为μ 型阿片受体激动剂，能诱导产生预处理样脑保护作用，我们在前期试验中发现瑞芬太尼预处理具有抑制神经元坏死和凋亡作用［4］。本实验通过进一步探究瑞芬太尼预处理对急性脑缺血损伤大鼠炎性因子表达影响的变化，继续探究其对脑损伤的作用机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与造模方法

健康SPF 级SD 大鼠60 只，鼠龄（12～15 周），空白组6 只，假手术组、急性脑缺血组、瑞芬太尼预处理组，每组各18 只，体质量（250±50）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验单位使用许可证编号为：SYXK 2012-0001，生产许可证号：SCXK 2016-0002，在动物实验房适应性喂养1 周后，参照longa 法［5］制备大鼠脑缺血损伤模型（MCAO）。造模成功后将各组在不同处死时间点6 h、12 h、24 h 进一步分为3 个亚组，每亚组6 只。假手术组：仅行左侧颈总动脉分离，缝合，不行血管结扎也不做缺氧缺血处理。瑞芬太尼预处理组：术前2 h 将大鼠装入鼠盒固定，行尾静脉穿刺并留置静脉套管针，接微量泵输入瑞芬太尼（人福医药公司，国药准字H20030197），给药剂量参照人与动物体表面积折算的等效剂量系数折算法［6］，每次输注5 min，连续3次，输注速率为0.8 μg·kg-1·min-1，每次输注完后给予5 min 间歇期，整个预处理过程约30 min。急性脑缺血组：操作步骤同瑞芬太尼预处理组，输注等量生理盐水代替瑞芬太尼。大脑MCAO 造模成功的标准：（1）患侧右前爪部分屈曲或完全屈曲；（2）行走时身体向偏瘫侧转圈；（3）行走时身体向偏瘫侧跌倒。

1.2 取样、切片制作

大鼠予10%水合氯醛麻醉后固定，剪开胸腹腔，暴露心脏，通过心脏快速灌注约100 mL 生理盐水，灌洗至肝脏变白，右心耳流出清亮液体后，再灌注4%多聚甲醛（PFA）溶液约150 mL 固定，至大鼠尾巴及四肢强直僵硬后，撬开颅骨，完整取脑放入生理盐水中漂洗残血后，置于4%多聚甲醛中固定。24 h 后脑组织取出切块，经不同梯度乙醇脱水，浸蜡，石蜡包埋，用切片机制作约4 μm 厚度的冠状切片，常规HE 染色后，光镜下观察缺血侧脑组织神经细胞形态病理变化。

1.3 RT-PCR 检测TNF-α、IL-6 及IL-8 表达水平

将大鼠缺血侧脑组织切下冷冻磨碎，匀浆处理至组织完全裂解，提取mRNA 后进行反转录，接着将获得的QPCR 引物与模板进行扩增，TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA 与β-actin 的引物用Primer 5.0软件设计，交由上海生工股份有限公司合成，合成得到的引物为冻干粉末，取适量的无酶水进行溶解，得到100 μM 的引物母液，稀释成PCR 扩增所需引物浓度为2 μM，序列如下见表1，结果计算：采用的内参基因为β-actin，LC 480 检测得出的CT 值为cDNA 荧光强度达到所设定阈值的循环数，ΔCt=目的基因CT 值-内参基因CT 值。每个样品中mRNA 相对表达量=2-ΔCt×100%

表1 PCR引物序列

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 神经功能缺损评分

空白组与假手术组大鼠的无神经功能缺损表现，在各时间点评分均无明显变化；急性脑缺血组和瑞芬太尼预处理组大鼠在术后均出现不同程度的神经功能缺损症状，与脑缺血组相比，瑞芬太尼预处理组大鼠神经功能缺损评分减轻，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠在不同时间点神经功能缺损评分（分，，n=6）

表2 各组大鼠在不同时间点神经功能缺损评分（分，，n=6）

注：与空白组及假手术组比较，aP＜0.01；与急性脑缺血组比较：bP＜0.05。

2.2 TTC 染色缺血侧脑组织结果分析

每组随机选取一块脑组织，加以修整，漂洗残血后放入4% PBS 固定、冰冻、切片，最后置于2% TTC 染色液中均匀染色。正常脑组织染色呈红色，梗死区呈现灰白色。结果可见：假手术组脑切片染色未见明显异常，脑缺血组和瑞芬太尼预处理组大鼠脑组织样本均可见大小不等、界线清晰的苍白色梗死区域；与脑缺血组相比，瑞芬太尼预处理组大鼠脑梗死体积明显缩小（P＜0.05）。见表3、图1。

图1 各组大鼠TTC染色缺血侧脑组织梗死体积图（肉眼可视图）

表3 各组大鼠脑组织梗死体积比较（，n=6）

表3 各组大鼠脑组织梗死体积比较（，n=6）

注：与假手术组比较，aP＜0.01；与急性脑缺血组比较，bP＜0.05。

2.3 大鼠脑组织HE 染色结果分析

大鼠脑组织HE 染色结果见图2。图2A、图2B为空白组及假手术组神经元染色情况，切片见大鼠神经元形态完整，呈圆或椭圆形，排列整齐，核仁明显，胞核染色清晰均匀。

图2C、图2D 是脑缺血组在处死点6 h、24 h染色情况，镜下6 h 时见胞体肿胀，缺血周围区明显水肿，梗死区域神经元结构模糊，排列不齐。在24 h 时神经元坏死和凋亡明显，水肿、肿胀减轻，胞体缩小，见大量固缩变性坏死神经细胞，细胞核消失，部分区域核固缩深染，边缘区炎性细胞浸润，胞质内形成微空泡。

图2E、图2F 为瑞芬太尼预处理组在处死点6 h、24 h 染色情况，在6 h 时细胞多层密集排列，胞膜较完整，水肿不明显，在24 h 时部分神经元胞体缩小，色深染，周围见少量固缩坏死神经元，炎性细胞浸润及少量胶质细胞增生，整体病理改变较脑缺血组减轻。

图2 各组大鼠缺血侧脑组织切片HE染色（×400）

2.4 各组大鼠脑组织TNF-α、IL-6 及IL-8 mRNA表达水平

大鼠造模后，空白组和假手术组的TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA 表达水平两组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组及假手术组两组比较，急性脑缺血组和瑞芬太尼预处理组TNF-α、IL-6及IL-8 mRNA 表达水平在各时间点均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与急性脑缺血组同时间点相比，瑞芬太尼预处理组的TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA 表达水平明显低于脑缺血组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4～6。

表4 各组大鼠脑组织TNF-α mRNA表达影响（，n=6）

表4 各组大鼠脑组织TNF-α mRNA表达影响（，n=6）

注：与空白、假手术组比较：aP＜0.01；与急性脑缺血组比较：bP＜0.05。

表5 各组大鼠脑组织IL-6 mRNA表达影响（，n=6）

表5 各组大鼠脑组织IL-6 mRNA表达影响（，n=6）

注：与空白、假手术组比较：aP＜0.01；与急性脑缺血组比较：bP＜0.05。

表6 各组大鼠脑组织IL-8 mRNA表达影响（，n=6）

表6 各组大鼠脑组织IL-8 mRNA表达影响（，n=6）

注：与空白组、假手术组比较：aP＜0.01；与急性脑缺血组比较：bP＜0.05。

3 讨论

脑缺血损伤后，大量炎性因子的释放与聚集会对神经元造成损伤或凋亡，进而诱发脑组织损伤［7］，其中机制之一启动了炎症级联反应程序，随着炎性因子释放与聚集的增加，神经元损伤进一步加重，使缺血性损伤向炎症性损伤转变，进而促使炎症级联反应放大，其过程涉及多种炎性细胞因子参与，以TNF-α、IL-6、IL-8 等为代表的炎性递质失控释放而形成的“瀑布效应”是脑缺血损伤的免疫炎症反应的基础［8］。TNF-α 是TNF 活性成分，既能调节机体免疫，控制IL-8、IL-6 等诸多炎性递质的生成及分泌，又可参与血管内皮损伤及凝血过程，在脑缺血性损伤中扮演重要角色［9］。IL-6 升高可致中性粒细胞趋化到炎症损伤的局部，分泌大量炎性递质，促进炎症瀑布形成，加重炎症损伤，影响神经细胞的修复［10］。IL-8 属于炎性反应型或诱导型的趋化性细胞因子，具有中性粒细胞趋化剂的所有特性，可诱导形态改变及趋化、细胞内游离Ca2+浓度一过性升高、颗粒内含物释放、黏附蛋白上调等，从而促进炎性反应［11］。脑损伤越重，炎性递质释放越明显，TNF-α 可促进脑损伤中的IL-8、IL-6 等因子的mRNA 转录及表达，而IL-8、IL-6则进一步刺激TNF-α 活化，协同起促炎作用。

缺血性脑损伤的病理生理机制复杂，目前尚缺乏有效的干预方法。近年来动物试验研究表明：药物预处理可能是防治缺血损伤的有效手段，部分脏器在经历一次或多次的短暂缺血后，对随后发生的长时间缺血有很好的耐受力，可明显减轻缺血所致的损伤。在药物预处理过程中，麻醉性镇痛药品是近年来预处理药物选择的热点之一。有关阿片类药物对脑缺血再灌注损伤的研究结果表明：δ、μ、κ 受体均参与了减轻脑缺血再灌注损伤的保护机制［12-13］。研究表明瑞芬太尼能调节线粒体的功能，μ 受体和δ 受体均是通过G 蛋白和K+通道相偶联，这两种阿片受体被激动后均可引起K+通道开放［14］，线粒体ATP 敏感性钾通道的开放，可减轻线粒体过氧化损伤而可能具有减轻脑缺血再灌注损伤的作用，而δ受体激活可减少谷氨酸盐和组织缺氧所引起的神经元的死亡［15］。此外，阿片受体通过降低环磷酸腺苷（cAMP）产生，减轻激活蛋白激酶A（PKA），从而PKA 对Ca2+激活的钾通道抑制作用减弱，细胞膜去极化作用减弱，Glu 释放减少，NMDA 受体激活减少，Ca2+内流减少，减轻“钙超载”，从而发挥脑保护作用［16］。本实验中瑞芬太尼预处理组TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平在各时间点明显低于急性脑缺血组，且神经细胞的病理反应减轻，提示瑞芬太尼预处理具有减轻炎性因子的作用，与临床报道一致［17］。

综上所述，瑞芬太尼预处理后大鼠脑梗死体积缩小，神经元病理反应减轻，脑组织炎性因子表达降低，表明瑞芬太尼预处理对急性脑缺血损伤具有一定的保护作用。