HPLC 内标法测定曲安奈德新霉素贴膏中醋酸曲安奈德的含量

王国英，周刚

内蒙古自治区药品检验研究院，内蒙古自治区 呼和浩特市 010020

曲安奈德新霉素贴膏是由醋酸曲安奈德、硫酸新霉素、麝香草酚、氧化锌等加入天然橡胶等基质制成的橡胶膏剂，上海卫生材料厂首次研发，临床主要用于局限性神经性皮炎、慢性湿疹及小面积的银屑病［1-3］，近年还发现它可有效地治疗结节性痒疹［4］、结节性疥疮［5］、荨麻疹［6］等。本品中的醋酸曲安奈德是一种具有持久抗炎作用的长效糖皮质激素药物［7］，多用于治疗诸如弥漫性风湿性关节炎、结缔组织疾病的治疗［8］。

经国家药品监督管理局网查询，该品种共有18个生产厂家、18 个批准文号，4 种规格，分别为4 cm×6.5 cm、5 cm×6.5 cm、7 cm×10 cm、8 cm×13 cm。通过对现行国内外标准进行查询，《中国药典》（Chinese Pharmacopoeia，ChP）、《英 国 药 典》（British Pharmacopoeia，BP）、《欧洲药典》（European Pharmacopoeia，EP）、《美 国 药 典》（United States Pharmacopoeia，USP）及《日本药局方》（Japanese British Pharmacopoeia，JP）仅收载了曲安奈德原料，均未收载曲安奈德新霉素贴膏。目前该品种收载于国家食品药品监督管理局（State Food and Drug Administration,SFDA）国家药品标准化药第十一册［9］，原标准检验项目设置简单，对两种有效成分仅进行鉴别实验，未对含量进行控制。为完善药品质量标准，本研究建立高效液相色谱内标法测定曲安奈德新霉素贴膏中醋酸曲安奈德含量，并进行了方法学验证，结果表明该方法科学合理，结果准确、可靠，可用于曲安奈德新霉素贴膏中醋酸曲安奈德的含量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂

岛津2010A型高效液相色谱仪；Millpore超纯水机；Sarlorius AL204、Sarlorius MSA125P-1CE-DI、Sarlorius MAX（SG EA）电子天平；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9145A 型电热鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司）。

试剂：甲醇（色谱纯），高纯水（实验室自制），正辛烷、乙醇（分析纯，国药试剂），其他为分析纯。

1.2 样品

醋酸曲安奈德对照品（批号100125-201406，纯度99.1%，来源：中国食品药品检定研究院）；炔诺酮对照品（批号100053-201807，纯度99.4%，来源：中国食品药品检定研究院）；三家企业提供的3 批曲安奈德新霉素贴膏，分别为企业A 样品（批号200203，规格4 cm×6.5 cm，），企业B 样品（批号200317，规格4 cm×6.5 cm），企业C（批号191002，规格4 cm×6.5 cm）含醋酸曲安奈德均不得少于16 μg/cm2，本次试验及方法学考察所用样品为企业A 样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长240 nm；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20 μL；以甲醇为流动相A，水为流动相B，按表1 进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序

2.2 标准溶液制备

2.2.1 内标溶液的制备 取炔诺酮对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL 中含0.20 mg 的溶液，作为内标溶液 。

2.2.2 对照品溶液的制备 取醋酸曲安奈德对照品适量，精密称定，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 mL 中含0.80 mg 的溶液，作为对照品储备溶液。分别精密量取对照品储备溶液与内标溶液各1 mL，置同一50 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取样品20 片，除去盖衬，取约2 片量（约52 cm2），剪成小块（约0.25 cm2），精密称定，置分液漏斗中，加50 mL 正辛烷，精密加内标溶液1 mL，振摇使膏体溶解，用90%乙醇分次萃取（50、15、15、10 mL），合并下层溶液，水浴蒸干，将蒸干的残渣加少量乙酸乙酯溶解，转移至50 mL 量瓶中，再用甲醇分次溶解剩余残渣，完全转移至上述容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验 按曲安奈德新霉素贴膏处方，除醋酸曲安奈德外，取2 片量的辅料，置50 mL 分液漏斗中，照“供试品溶液的制备”项下方法处理，制备阴性对照溶液，取空白溶剂及阴性对照溶液，按照“2.1”项下色谱条件检测，结果显示，空白溶剂及辅料在醋酸曲安奈德及内标物质出峰时间内对测定不存在干扰，专属性较好。见图1。

图1 专属性试验液相色谱图：A.空白溶剂；B.阴性对照溶液；C.对照品溶液；D.曲安奈德新霉素贴膏供试品溶液

2.3.2 线性关系考察 精密称取醋酸曲安奈德对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL 含醋酸曲安奈德0.40 mg 的溶液，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mL，分别置50 mL 量瓶中，分别加入内标溶液1 mL，加甲醇稀释至刻度，作为系列浓度标准溶液。按照“2.1”项下的色谱条件检测，以浓度为横坐标（X），A（对照品）/A（内标）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为：Y=6.635 4X+0.085 2（n=6，r=0.999 0）。结果表明醋酸曲安奈德在4 μg/mL～40 μg/mL 内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 精密量取同一批供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，测定得醋酸曲安奈德含量的相对标准偏差（RSD）为0.9%，结果表明该实验方法精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 照“供试品溶液的制备”项下处理供试品1 份，分别于0、6、12、24、36、48 h 进行了测定，48 h 内结果RSD 为1.9%，表明供试品溶液48 h 内稳定性较好。

2.3.5 重复性试验 取样品，照“供试品溶液的制备”项下方法，平行制备6 份溶液，并按照“2.1”项下色谱条件检测，结果测得醋酸曲安奈德平均含量为17.4 μg/cm2，6 份样品RSD 为1.8%，实验结果表明该方法重复性良好。

2.3.6 回收率试验 取样品20 片，除去盖衬，精密称定，剪成小块（约0.25 cm2），取约1 片量，精密称定，置分液漏斗中，按表2 加入对照品，照“供试品溶液制备”项下方法自“加50 mL 正辛烷……”进行处理，得供试品溶液，并按照“2.1”项下色谱条件检测，结果显示，低、中、高三个浓度回收率在98.5%～100.6%，平均回收率为99.4%，9 份回收率RSD 为0.7%，表明该方法准确度良好，结果见表2。

表2 回收率试验结果

2.3.7 耐用性试验 取对照品溶液分别对柱温、流速、色谱柱、仪器进行耐用性试验考察，通过改变柱温25 ℃、30 ℃、40 ℃，改变流速0.8、1.0、1.2 mL/min，更换不同品牌色谱柱CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ（4.6 mm×250 mm，5 μm），phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）及不同品牌高效液相色谱仪岛津LC-2010，Agilent 1260，进行方法耐用性试验，结果显示各峰理论塔板数、分离度均能达到检测要求，表明方法耐用性较好。

2.4 样品含量测定

取3 个厂家的3 批样品，分别照“供试品溶液制备”项下方法，制备供试品溶液，每批样品制备2 份，并按照“2.1”项下色谱条件检测，计算含量，结果见表3。

表3 不同生产厂家醋酸曲安奈德测定结果

3 讨论

3.1 方法建立的意义

曲安奈德新霉素贴膏现行法定标准中，未对醋酸曲安奈德的含量进行控制。近十年文献显示，仅两篇文献报道了该品种含量测定方法，均使用石油醚提取后再用乙醇沉淀的方法［10-11］。实际操作过程中发现，由于贴膏剂基质复杂，处方中含有天然橡胶，且各企业生产工艺各不相同，复杂的样品前处理过程，导致平均回收率仅能达到92%［1］，因此有必要建立一个快速、简便、可靠、准确度高、重复性好的方法，为该制剂的质量控制提供方法依据。

3.2 提取方法的制定

3.2.1 提取溶剂的选择 法定检验标准中测定含膏量时，采用了90～120#汽油作为溶剂，本实验分别对97#汽油、93#汽油、石油醚、正辛烷进行了考察。采用浸泡半小时、振摇、待膏体全部溶解后分次加入50 mL 乙醇萃取的方法进行提取［10］。实验结果显示，加入石油醚、97#汽油、93#汽油溶解的膏体有沉淀产生，而正辛烷作为溶剂时，加入乙醇后无沉淀产生，出现分层现象，且测定结果显示，正辛烷提取效率优于93#汽油、97#汽油和石油醚，93#汽油、97#汽油较难获取，因此选择正辛烷作为提取溶剂。

3.2.2 方法准确性验证 选取正辛烷为提取溶剂，分别制备3 份供试品溶液及3 份回收率实验溶液，结果表明，3 份供试品含量的RSD 为5.0%，回收率在92.6%～110.0%之间，RSD 为8.6%，证明提取平行性较差，导致结果准确度下降。参考《中国药典》2020 年版二部中醋酸曲安奈德乳膏［12］，加入炔诺酮作为内标物质进行测定。

3.2.3 正交试验优化提取方法 考虑到样品基质复杂，提取过程繁琐，通过设计一个三因素三水平的实验，分别选定萃取用乙醇浓度、萃取次数、裁剪大小作为三个因素，每个因素设计三个水平，按L9（34）正交表安排实验，9 组实验结果显示，对实验结果影响最大的因素是萃取用乙醇的浓度，提取最佳条件是将贴膏剪成0.25 cm2的小块，用90%乙醇萃取4 次。