气相色谱法测定石杉碱甲合成中间体基因毒性杂质苯硫酚

陈安，孙利荣，赵云超，李娟

万邦德制药集团有限公司，浙江 温岭 317500

石杉碱甲（huperzine A）是从石杉科植物千层塔中分离得到的一种天然生物碱，是一种具有高特异性且可逆的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂［1-2］。石杉碱甲在动物模型中表现出能够减弱或者逆转认知损害［3-4］，在临床上也已经被证明能显著改善衰老性健忘老年人和老年痴呆或血管性痴呆患者的记忆缺陷，不良反应发生率低，有较好的临床安全性［5-6］。1996 年，石杉碱甲在国内按二类新药批准其用于阿尔茨海默病（AD）的治疗［7］。

石杉碱甲易透过血脑屏障、作用时间长、口服利用度高，被许多医院广泛应用于AD 的治疗［8-9］，而通过植物提取所得到的石杉碱甲得率低，极大限制了其临床应用，通过人工合成的方法能够实现石杉碱甲产业化［10］。1989 年，A.P.Kozikowski 课题组［11-12］实现了石杉碱甲的全合成，之后，嵇汝运院士所在课题组［13］对石杉碱甲合成工作做了总结。在合成石杉碱甲中间体过程中使用了苯硫酚钠而产生了苯硫酚，苯硫酚具有较高毒性，危害中枢神经系统，导致肌肉萎缩、呼吸困难、昏迷等症状［14-16］，因而建立一种苯硫酚的检测方法非常重要。目前，未见有基因毒性苯硫酚质量控制的气相色谱方法报道。为有效控制石杉碱甲的质量和用药安全，本实验采用气相色谱法对苯硫酚进行考察，并进行方法学验证，为石杉碱甲合成中间体的质量标准提供数据支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

7890B 型气相色谱仪（美国Agilent 公司）；MS205DU 型电子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 试药

苯硫酚（分析纯，纯度99.0%，批号：11872，山东西亚化学工业有限公司）；乙酸（分析纯，批号：20190810，江苏强盛功能化学股份有限公司）；乙腈（色谱纯，批号：0114210101，上海星可高纯溶剂有限公司）；石杉碱甲合成中间体（LE-11，甲基（5R，9R，E）-11-亚乙基-2-甲氧基-7-甲基 -9,10-二氢-5,9-甲基环辛基［b］吡啶-5（6H）-羧酸盐，CAS：185741-44-0，批号：QSSJJ11191001，万邦德制药集团有限公司提供）。

2 方法与结果

2.1 试验条件

色谱条件：岛津Inert Cap 5 毛细管柱（30 m×0.53 mm×1.5 μm）；升温程序：起始柱温为40 ℃，维持10 min，以10 ℃/min 的速率升温至220 ℃，以30 ℃/min的速率升温至280℃，维持19 min；进样口温度为220 ℃；检测器为FID，检测器温度为280 ℃；空气流量为300 mL/min；氢气流量为30 mL/min；尾吹气25 mL/min；载气为氮气，流量为4.0 mL/min；分流比为5∶1；进样量：1 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 空白溶液 以乙腈:乙酸（97∶3，v/v）为空白溶液。

2.2.2 对照品溶液 精密称取苯硫酚101.22 mg，置于100 mL 量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，得对照品储备溶液1；精密移取10 mL 对照品储备溶液1，置于100 mL 量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，得对照品储备溶液2；精密移取10mL对照品储备溶液2，置于100 mL 量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。

2.2.3 加标供试品溶液 精密称取1.0 g 的LE-11，置于10 mL 量瓶中，精密移入1.0 mL 对照品储备溶液2，加空白溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得加标供试品溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验 取“2.2”项下配制的空白溶液、对照品溶液和加标供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分别进样，色谱图见图1。结果显示，空白溶液无干扰峰，加标供试品溶液中中苯硫酚与供试品自带的杂质峰之间分离度为4.96，理论塔板数和拖尾因子均符合要求，表明专属性良好。

2.3.2 线性关系考察 精密量取“2.2.2”项下的对照品储备溶液2 各1.5、3.0、5.0、7.5、10.0 mL，分别置于50 mL 量瓶中，加入空白溶液稀释至刻度，摇匀。分别精密移取上述系列溶液置于进样瓶中，加盖密封。按照“2.1”项下色谱条件进行分析测定，以质量浓度X为横坐标（μg/mL）、峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。得到回归方程为Y=2.816 4X-1.770 5，相关系数r=0.999 7，结果表明苯硫酚在3.006 2～20.041 6 μg/mL 的质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度考察 精密量取对照品溶液置于进样瓶中，密封摇匀，平行配制6 份，按“2.1”项下色谱条件分析测定，计算得到苯硫酚峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.79%（n=6），表明精密度良好。

2.3.4 检测限和定量限 取“2.2”项下的对照品溶液，并逐级稀释成一定浓度，分别进样，以信噪比为3 时（S/N=3）的浓度作为最低检测限度（LOD），以信噪比为10 时（S/N=10）作为定量检测限浓度（LOQ），结果：苯硫酚检测限为0.995 5 μg/mL，定量限为2.986 6 μg/mL。

2.3.5 加样回收率试验 取LE-11 供试品各约1.0 g（共9 份），精密称定，分别置于10 mL 量瓶中，精密移取对照品储备溶液2 各0.8、1.0、1.2 mL，分别置于10 mL 量瓶中，配制低、中、高3 种质量浓度的对照品溶液，每个浓度溶液配制3 份，加入空白溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图（见图1），计算回收率。回收率结果见表1，表明残留溶剂回收率满足要求。

表1 苯硫酚回收率实验结果

2.3.6 耐用性试验 取“2.2”项下的对照品溶液和加标供试品溶液各1 μL（因为纯供试品中苯硫酚的量很少，不能很好地考察苯硫酚在供试品中的分离度，所以采用供试品加标的方式进行考察苯硫酚在供试品中的分离度），进样分析，微小改变“2.1”项下色谱条件，测定，记录色谱图（见图1），计算得出理论塔板数、拖尾因子、分离度。结果见表2，表明初始温度变化±2 ℃、载气流速变化±0.2 mL/min、更换不同批号的色谱柱、初始保留时间±1min，以及升温速率±2 ℃/min 条件下，方法的耐用性良好。

表2 耐用性试验结果

图1 气相色谱图：A.空白溶液；B.对照品溶液；C.加标供试品溶液

2.3.7 稳定性试验 对照品溶液和加标供试品溶液现配现用，置于进样瓶中，密封摇匀，依次于0、3、6、9、12、18、24、36、48 h 进样分析，记录色谱图，以各时间点苯硫酚峰面积与0 h 苯硫酚峰面积的比值作为衡量溶液是否稳定的标准（80%～120%）。结果见表3，说明对照品溶液在48 h 内稳定性良好，加标供试品溶液在12 h 内稳定。

表3 稳定性试验结果

2.3.8 含量测定 分别精密称取1.0 g LE-11，置于10 mL 量瓶中，使用空白溶液超声溶解，摇匀，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果供试品溶液中的苯硫酚含量为0.001%。

3 讨论与结论

气相色谱法的进样方式有顶空进样法和直接进样法，低沸点溶剂适合顶空进样，高沸点溶剂适合直接进样［17-18］。在试验中发现，苯硫酚在顶空进样时发现无响应，直接进样能很好出峰，故最终选择直接进样的方式。

苯硫酚不溶于水，易溶于有机溶剂，且针对石杉碱甲中间体LE-11 的溶解性，开始选择乙腈∶乙酸乙酯作为空白溶液进行试验，发现在对照品溶液中苯硫酚比较稳定，但是当苯硫酚加入到供试品溶液3 h后苯硫酚变得不稳定，由于苯硫酚在弱酸性的环境下，它会形成自由基，而这些自由基可能会跟样品中的不饱和烃加成，最终使苯硫酚降解，故我们选择在溶液中加入一定量的酸，使我们的溶液变成酸性，让苯硫酚不那么容易形成自由基；经过试验调整最终选择乙腈∶乙酸=97∶3（v/v）作为空白溶液。

由于选择了直接进样的方式，样品的主成分也会有出峰的可能，且其沸点较高，选择弱极性的色谱柱可以快速有效的分析，所以本试验选择岛津Inert Cap 5 作为色谱柱，该色谱柱独特的内壁表面去活技术彻底清除了残余在管内表面的卤代化合物、硅烷醇基团和金属粒子，保障了在快速分析的同时能有一个较好的峰型。

通过对专属性、仪器精密度、检测限和定量限、加样回收率、稳定性、耐用性等方法学考察，说明本方法能够对基因毒性杂质苯硫酚进行较好的质量控制。