p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的相关性研究

涂开峰

p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的相关性研究

涂开峰

（黄冈职业技术学院 医学部，湖北 黄冈 438002）

探讨p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的相关性。采用黄冈市中心医院肿瘤科肝癌组织标本30例。运用饱和酚-氯仿法，提取DNA。根据GenBank数据或其他参考文献，设计出1对p53基因外显子8的PCR引物。进行PCR扩增，观察目标条带，将PCR产物进行纯化、测序、分析。免疫组织化学方法SP-p16,对其突变和缺失进行分析。在近30名肝癌患者体检中，有15名检测到血浆循环核酸 p53突变。有癌转移史的病人17例突变率大大高于癌未发转移前13例。p53基因突变和血浆p16基因编码缺陷都与肝癌的发生、严重化程度加重和癌转移发生有关。

肝癌；基因；p53突变；p16缺失

肿瘤是一种严重威胁着全人类健康的疾病，随着实验技术和近代分子生物学理论的发展，人们对肿瘤发生机制的研究已进入到分子水平。近年来还发现细胞中存在抑癌基因，其功能失活,失去了对原癌基因的抑制，从而促进了肿瘤的发生及发展[1]。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是目前公认的世界上第六大最常见的恶性肿瘤，并且它在其过去近十年时间中死亡率呈上升之趋势。手术技术的进步极大改善提高了早期肝癌患者手术的安全性和预后。然而,由于这种高自然死亡率，肝癌患者最终的预期总生存率估计仍然还是很低。研究已经表明，肝癌早期恶性发展可能是一个多方面、多阶段变化的演变过程，也是一种个人习惯性自发地激活体内许多癌基因，使其被长期抑制后的抑癌基因和凋亡细胞的调控机制失调引起肝细胞的功能异常失活[2]。p53肿瘤细胞凋亡抑制基因位于人类染色体的17P13.1, 长约 20 KB，包含着约10个染色体内部基因、11个染色体外部的基因和另外有5个染色体相对保守的区域。p53基因突变是多种人类恶性肿瘤中最常见的遗传变化，其中大部分发生在保守区域的5-8外显子上。有报道称，许多国家的肝细胞癌（HCC）中发现p53基因突变[3]。综合以上研究报道，我们认为 p53基因外显子8的突变可能与肝癌有关，因此本研究拟验证肝癌与p53基因外显子8突变的关系，进一步研究p53基因相互作用在肝癌发生发展中的生物学机制，可为肝癌患者的鉴别诊断和基因治疗提供新思路，具体内容如下:

1 资料与方法

1.1 标本采集

本课题拟采用黄冈市中心医院肿瘤科肝癌组织标本30例。所有患者均通过腹部超声、CT 或 MRI、CEA 和 AFP 蛋白肿瘤研究确定。本研究共纳入30例肝癌患者，其中肝癌无转移13例，肝癌并发肺、胃、肠、脑转移17例。 男21例，女9例，年龄28～70岁，平均（49±21）岁。无论时间、饮食和治疗如何，血浆都与静脉血分离。30例正常对照为献血员血，男20例，女10例，年龄26～56岁，平均（41±15）岁。

1.2 实验方法

（1）根据GenBank数据或参考文献，设计1对p53基因外显子8的PCR引物。

（2）组织DNA提取：将实验标本研碎，用蛋白酶K进行消化，运用饱和酚-氯仿法，提取DNA。

（3）聚合酶链反应法(PCR扩增)方法：PCR循环条件：98℃条件预冷下变性时间为5 min，然后开始热循环进行扩增，94℃条件下变性时间为30 s，退火后变性延续时间长约为45s，74℃条件延伸约为1 min，共计有35个扩增循环。经加1.5%甘油的琼脂凝胶电泳，在紫外分析仪检测条件下均可肉眼观察其电泳结果，拍片留存，PCR产物4℃保存。

（4）DNA测序PCR产物纯化后，采用双脱氧法，通过比较ncbi BLAST确认结果。

（5）免疫组化方法采用SPSS27.0方法，当数据比较＜0.05是为具有统计学差异。p16单克隆抗体及试剂由成都医药集团购买，当Aneniospora呈棕色和蓝色时，蛋白 p16 呈阳性。对于每个部分，计算了5个高倍放大区域。细胞阳性5% ，阳性对照为同簇实验对照。

2 结果

2.1 p53基因突变

p53基因突变和转移癌的遗传相关性(表1)和p53基因的突变率(表2)的分布不同。

表1 HCCp53基因突变与转移癌的联系[n，（%）]

表2 15例HCC患者p53基因病灶外明显突变分布

2.2 p53 基因突变相关性分析

正常对照组30份血浆样本检测结果为阴性（运动无变化），30名肝病患者15份血浆样本检测结果为阳性（有运动变化）。30例HCC患者中，15例（15/30，50.00%）血浆基因p53发生突变，且大部分位于第8外显子（5/15，33.33%）。 外显子5-8结果显示，转移HCC组的p53型HCC的基因变化率远高于非转移组（P<0.0.05）。 因此，可以假设癌基因抑制突变与恶性相关事件有关（x = 65.27，P <0.05）。

2.3 p16 基因缺失

p16基因缺失程度见下表3。细胞核基质内棕蓝色微粒检测呈阳性，分布很均匀。根据样本的位置，无转移组织切片发生率高于有转移组织切片，分别为 88.24% (15/17) 和 11.76% (2/17)。 统计分析显示差异有统计学意义（x=6.073，P<0.01）。

表3 p16基因缺失与转移癌的联系[n，（%）]

3 讨论

肝癌分为原发性和继发性肝癌，其中最常见的是原发性肝癌，占70%到90%之间，在我国最常见的恶性肿瘤中排名第六[4]。肝癌病人的术后5年内生存率一般相对较低，仅约为10.1%，且由于其主要发病机制至今尚还不明确[5]，因此从分子水平研究肝癌的发病机制对肝癌患者的诊断、治疗以及预后都具有重要的临床意义。

在人类的肿瘤发生中，p53基因突变是最常见的基因水平变化。目前已有几十个已知基因的肿瘤抑制，其中p53调控细胞生长的功能以及与肿瘤发生的密切关系，确切了解p53基因、蛋白各方面的性质，以及p53实现其生物学功能的机制，有助于阐明细胞生长调节以及肿瘤发生的详细机制。但由于体内游离p53含量的水平低、半衰期含量低和诱导寿命长，一般试验都未直接显示出游离p53水平对肿瘤细胞增殖生长明显的抑制化作用。根据上述实验，30名患者中有15名（50.00%）p53突变。p53 突变发生在HCC患者中可能是由于染色体突变或免疫功能发生改变或染色体内p53基因表达的严重缺失，可以防止细胞生长的缺失[6]。通过p53基因突变与转移癌的遗传相关性实验研究的数据显示，p53基因突变HCC阳性病例中64.71%完全发生了肿瘤转移，30.77%无出现任何转移，这些试验研究结果则均表明HCC的p53基因的突变与患者的肝癌转移有关。上述的许多研究均可表明，HCC p53基因突变存在确切可能性至少比一般人类已知的HCC高出得多 (P <0.05)，部分原因也认为它是由于抑癌基因的突变与恶性肿瘤事件的发生率及其恶性程度和其在临床中恶性肿瘤的预后直接有关。人类遗传学中p53基因突变发生形式主要为有缺失突变、点位突变、移码突变和基因重排。突变发生的位点主要的是位于外显因子5～8。结果显示，15例p53基因突变序列中，第5外显子只能占到约20.00%，第6外显子也就是只有占到了大约20%，第7外显子也可以占到了26.67%，第8位外显子也才只能占到了大概33.33%。p53的基因突变的特点是错误突变导致蛋白质功能发生变化，其中一些是无义的或停止突变。p53突变是原发性肝癌中最常见的突变，p53杂合等位基因缺失的频率可以达到25％～60％。随着技术和研究的不断进步，致癌抑制基因检测技术的发展，必须早期发现，鉴别诊断，及时干预肿瘤，这对于肿瘤患者的诊治具有重要价值。

p16基因调节家族成员中（MTSI、CDR41、CDRN2）是用于调节细胞周期的基因调控家族成员中的重要组成部分。通过病例结果的分析显示，无转移组与转移组比较差异有统计学意义（88.24%（15/17）、11.76%（2/17）），差异有统计学意义（P<0.01）。p16的主要作用是通过细胞蛋白调节S期来抑制G1期。在缺失或失活的情况下，异质细胞酶链中某些酶有相对过高活性都可能进一步导致某些基因磷酸化、E2F等转录异常调控，从而导致了转录G1期功能的突然失控,细胞分子在转录S期突然发生的异常增殖分裂，最终导致不需要的变化[7]。因此,研究肝癌p16基因缺失的影响程度将对于探讨肝癌肿瘤的基因发生、诊断、治疗过程和术后修复过程至关为重要。

总之，本研究试图通过比较对p53基因和p16基因在肝癌的发生中相互作用的生物学机制，这些机制不仅在分子水平上有明确界定，虽然还有一定的局限性，具体对应无法确定，但对临床基因疾病诊断分型和药物基因表达治疗应用提供了初步实验依据。

[1]王佳斌,孙成英,马燕春.C-myc、p16、p53基因与老年患者胃黏膜癌变幽门螺杆菌感染的关系研究[J].临床消化病杂志,2018, 30(3):136-139.

[2]卞春安,蒋琰华,陆世民,et al.p53和p16基因过表达对人肺腺癌细胞株H1299生物学功能影响实验研究[J].中华肿瘤防治杂志,2018, 25(5):307-314.

[3]姬媛媛,王志东,陈海燕,等.IGF-Ⅱ对人肝癌细胞HepG2中抑癌基因p16和p53表达的影响[J].现代肿瘤医学,2017,25(12):53-58.

[4]石岩,肖继辉.p53,PTEN,p16,HER-2和Ki-67蛋白表达与子宫内膜癌的关系研究[J].肿瘤基础与临床,2019,32(4):338-340.

[5]罗春华,雷丽云,申九妹,等.APC和p53及K-RAS基因突变与结直肠腺瘤术后复发关系探讨[J].社区医学杂志,2021,19(24):1466-1470.

[6]尚文涛,王敏娜.p53基因在癌症发展过程中作用的研究[J].世界最新医学信息文摘,2018, 18(20):34-35.

[7]卫云峰,丁倩,郭道宁,等.肝细胞性肝癌患者超声检测血流分级与血清HMGB1,SCCAg,P53蛋白表达的关系[J].生物医学工程与临床,2020,24(3): 267-271.

On Correlation between p53 gene Mutation and p16 Gene Deletion with Liver Cancer

Tu Kaifeng

(Huanggang Polytechnic College, Huanggang 438002 Hubei)

To investigate the correlation between p53 gene mutation and p16 gene deletion and hepatocellular carcinoma.Thirty cases of liver cancer tissue samples were collected from Huanggang Central Hospital. DNA was extracted using the method of saturated phenol - chloroform. According to GenBank data or other references, a PCR primer for exon 8 of p53 gene was designed. PCR amplification was performed, the target bands were observed, and the PCR products were purified, sequenced and analyzed.In nearly 30 patients with liver cancer check-up, plasma circulating nucleic acid was detected in 15 of p53 mutations. 17 patients with a history of cancer metastasis mutation rate much higher than 13 cases before carcinoma without metastasis.Both p53 gene mutation and plasma p16 gene coding defect are associated with the occurrence, severity and metastasis of HCC.

Liver cancer; Genes; P53 mutations; Loss of p16

R735.7

A

1672-1047（2022）03-0081-03

10.3969/j.issn.1672-1047.2022.03.21

2022-05-14

湖北省教育厅科学技术研究计划指导性项目“肝癌与p53基因外显子8突变的相关性研究”（B2021481）。

涂开峰，男，湖北红安人，三级主任医师。研究方向：基础医学。

[责任编辑：曾华]