不同陈化年份、不同产地陈皮药材的六君子汤指纹图谱的建立

尚尔雨，申国涛，于 新，孙 爽

(1.黑龙江省森林保护研究所，哈尔滨 150040； 2.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 150040)

陈皮(CitriReticulataePericarpium)为临床常用中药，是芸香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮，道地药材为广东新会的茶枝柑果皮[1]。陈皮具有理气健脾、燥湿化痰的功效。《本草纲目》记载：“陈皮，苦能泄能燥，辛能散，温能和，其治百病，总取其理气燥湿之功，同补药则补，同泻药则泻，同升药则升，同降药则降”，因此陈皮是一味非常有代表性的理气药[2]。陈皮为六君子汤中发挥主要作用的一味药。六君子汤出自《医学正传》，作为基础方加味治疗脾胃病证，现代临床常用于慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡等属脾胃气虚者[3-5]。实验研究表明，六君子汤药理作用广泛，可通过调整细胞因子间的网络平衡，改善胃肠道的内分泌功能，减轻胃黏膜的炎症反应，从而发挥对胃黏膜的保护作用[6-7]。

陈皮的复方配伍能够起到增效作用。李波[7]等研究发现，陈皮与人参配伍，补而不滞，能够增强抗疲劳作用。李苑等人[8]研究发现，陈皮与黄芪、党参、白术、甘草等配伍，组成补中益气汤，其有效成分橙皮苷含量配伍过程中有显著变化。陈皮作为理气药物，对补气药物的增效作用是毋庸置疑的，且其挥发类和黄酮类成分也与胃肠道调节和脂质调节密切相关。但是，在补气方剂中，陈皮究竟有哪些成分、以什么途径来增加其他药物疗效，目前还未见报道。采用现代分析方法，对陈皮协同增效的物质基础与作用机制进行了研究。

中药是多靶点、多成分、共同发挥疗效的复杂体系，单味中药不能全面反映中药的质量，而应采用更完整性的技术与方法来进行中药质量的评价[9-10]。

中药指纹图谱技术是一种综合的、可量化的定性定量手段，具有“整体性”特点，能全面反映中药的综合质量，可用于控制和评价中药材的质量[11-14]。

以《本草纲目》所载陈皮“同补药则补”理论为出发点，基于代谢组学研究策略，以陈皮拆分组分与理气补气作用的相关性为切入点，选取15批不同陈化年份、不同产地的陈皮药材作为实验对象，采用HPLC法，建立不同产地陈皮的特征指纹图谱，并进行相似度分析及聚类分析，为“谱-效”关系研究奠定了基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司生产)；AB265-S托利多十万分之一电子分析天平(瑞士托利多国际贸易有限公司生产)；SB-5200D SCIENTZ超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司生产)；BUCHI R-210型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI有限公司生产)；指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)。

1.2 试药

对照品川陈皮素(批号17050510)、芸香柚皮苷(批号18030408)、橙皮苷(批号171203)、橙皮素(批号171121)；3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黄酮(批号171108)、维采宁-2(批号170610)、甜橙黄酮(批号180117)、异甜橙黄酮(批号180366)、橘皮素(批号170510)；5-去甲川陈皮素(批号170816)。以上对照品均购自北京世纪奥科生物科技有限公司，对照品质量分数≥98%；甲醇、乙腈，色谱纯(美国 Mreda 公司生产)；甲酸，色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司生产)；实验用水为娃哈哈纯净水。陈皮水煎液及含有不同陈化年份、不同产地陈皮的六君子汤及六君子汤各阴性液均为自制。陈皮、人参、半夏、茯苓、白术、炙甘草均购于哈尔滨市同仁堂大药房。以上药材经黑龙江中医药大学药学实训教研室吕邵娃教授鉴定为正品，标本存放于黑龙江中医药大学药学院实验室。

15批从广东省收集到的不同陈化年份、不同产地的陈皮，如表1及图1所示。

表1 15批陈皮陈化年份及产地Tab.1 15 batches of Citri Reticulatae Pericarpium of different aging years and origins

图1 15批不同陈化年份、不同产地的陈皮药材Fig.1 15 batches of Citri Reticulatae Pericarpium medicinal materialsof different aging years and origins

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Venusil XBP C18(L)色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流动相为乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)溶液。梯度洗脱：0～10 min ，90%(甲酸水)；10～50 min ，90%～78%(甲酸水)；50～60 min ，78%～72%(甲酸水)；60～95 min ，72%-42%(甲酸水)；95～100 min， 42%～90%(甲酸水)。检测波长300 nm，柱温30℃，体积流量1.0 mL/min。

2.2 对照品溶液的制备

称取川陈皮素、芸香柚皮苷、橙皮苷、橙皮素、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黄酮、维采宁-2、甜橙黄酮、异甜橙黄酮、橘皮素、5-去甲川陈皮素标准品适量，精密称定，分别置于10 mL容量瓶中，分别加甲醇溶液溶解并稀释至刻度，制得对照品供试液。

2.3 样品供试液的制备

六君子汤古方为陈皮(一钱)，半夏(一钱五分)，茯苓(一钱)，甘草(一钱)，人参(一钱)，白术(一钱五分)，水煎煮。根据古今单位及比例换算得煎煮工艺，分别准确称取人参、茯苓、炙甘草、陈皮各3 g，白术、半夏各4.5 g，另加大枣二枚，生姜三片，按照上述方剂标准煎煮共10剂六君子汤。药材浸泡1.5 h，煎煮2次，每次加10倍量水，每次煎煮60 min。陈皮为广东省的道地药材，故又名广陈皮或新会陈皮。实验样品为分别从广东省收集到的不同陈化年份、不同产地的15批陈皮，分别以相同的方法和条件制备陈皮水煎液、含有不同陈化年份、不同产地陈皮的六君子汤及六君子汤各阴性液。分别量取100 mL药液，6 000 r/min离心10 min后取50 mL上清液置分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次，每次50 mL。合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇适量分次溶解，移置10 mL量瓶中，加甲醇定容，作为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取同一份六君子汤样品(S1)，精密吸取供试品溶液20 μL, 连续进样6次，记录6张六君子汤的HPLC图谱。结果可知，在6次进样中，各共有峰相对保留时间与相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱要求。

注：S1、S2、S3、S4、S5、S6分别表示供试品溶液重复进样6次，R表示6张图谱生成的共有模式图谱。图2 六君子汤精密度试验Fig.2 Precision test of Liujunzi Decoction

注：S1、S2、S3、S4、S5、S6分别表示同一批药材的6份供试品溶液，R表示6张图谱生成的共有模式图谱。图3 六君子汤重复性试验Fig.3 Repeatability test of Liujunzi Decoction

2.4.2 重复性试验

取同一批陈皮药材(S2)，按照供试品溶液的制备方法，重复制备6份六君子汤溶液，连续进样6次。由结果可知，在6次进样中，各共有峰相对保留时间与相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明该测定方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取同一份六君子汤溶液(S3)，分别在室温下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时进样。由结果可知，在6次进样中，各共有峰相对保留时间与相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明样品供试液在24 h内稳定。

注：S1、S2、S3、S4、S5、S6分别表示同一供试品溶液分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时生成的谱图，R表示6张图谱生成的共有模式图谱。图4 六君子汤稳定性试验Fig.4 Stability test of Liujunzi Decoction

2.5 指纹图谱的建立及分析

2.5.1 指纹图谱的建立

取表1所示的不同陈化年份、产地的陈皮药材，加入到六君子汤陈皮阴性液中，药材浸泡1.5 h，煎煮2次，每次加10倍量水，每次煎煮60 min，分别制备15批六君子汤，按“2.3.4”项下方法进样检测，记录色谱图及其特征数据。采用国家药典委员会推荐的中药指纹图谱相似度计算软件(中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版)进行六君子汤指纹图谱的建立，如图5、6。

图5 15批六君子汤HPLC指纹图谱Fig.5 HPLC fingerprint of 15 batches of Liujunzi Decoction

注：R为软件自动生成的15批六君子汤的对照图谱图6 15批六君子汤HPLC指纹图谱与对照图谱Fig.6 15 batches of Liujunzi Decoction HPLC fingerprint and comparison map

2.5.2 共有峰的归属与指认

经过中药指纹图谱相似度计算软件分析出15批六君子汤样品中共具有69个共有峰，将各峰依次标记为X1～X69，并分别与各阴性液进行对比，以指认每个共有峰的峰归属，结果如图7所示。其中，X2(T7.842)、X6(T11.047)、X8(T11.716)、X60(T75.692)来自于六君子汤中的白术；X22(T33.968)、X47(T58.266)、X48 (T60.046)来自于六君子汤中的茯苓；X16(T25.285)、X33(T45.707)、X39(T50.309)、X50(T61.585)、X51(T64.615)、X58(T73.637)、X59(T74.107)、X63(T78.309)、X64(T79.092)、X65(T82.802)、X66(T83.671)、X67(T85.663)、X68(T88.117)、X69(T92.439)来自六君子汤中的陈皮；其他共有峰(X1、X3～X5、X7、X9～X15、X17～X21、X23～X32、X34～X38、X40～X46、X49、X52～X57、X61～X62)所对应的化合物可能为复方中某几味药配伍所产生的，这是由于该实验是在陈皮的最佳色谱条件下进行测定的，导致六君子汤中其他药味所含有的成分在该色谱条件下分离度不佳，指认结果见图8。

注： S1为六君子汤样品、S2为人参阴性样品、S3为甘草阴性样品、S4为白术阴性样品、S5为茯苓阴性样品、S6为半夏阴性样品、S7为陈皮阴性样品图7 六君子汤与各阴性液对比图Fig.7 Comparison of Liujunzi Decoction and each kind of negative liquid

注：峰16：维采宁-2；峰33：芸香柚皮苷；峰39：橙皮苷；峰58：橙皮素；峰63：甜橙黄酮；峰64：异甜橙黄酮；峰65：川陈皮素；峰67：3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黄酮；峰68：橘皮素；峰69：5-去甲川陈皮素图8 15批六君子汤共有模式图谱中各峰的指认Fig.8 Identification of peaks in the shared pattern map of 15 batches of Liujunzi Decoction

2.5.3 相似度分析

对上述15批六君子汤样品的指纹图谱数据进行分析，以对照图谱为参照，各样品指纹图谱与对照图谱进行比较，计算得到各批次六君子汤样品的相似度(相关系数法)，相似度评价结果见表2。由表2可知，总体显示15批六君子汤样品的相似度在0.753～0.985，说明各批次样品之间有一定的差异，其中，S1、S10、S11、S12、S13与对照指纹图谱的相似度较小。产生差异的原因可能为：不同产地之间相对地理位置的微小差异、陈化时间及品种对陈皮的影响。但是仅从相似度分析结果无法准确判断造成不同厂家、不同陈化年份样品之间差异的化学成分，因此须采用化学计量学的手段进行分析，寻找造成差异的化学成分，以控制六君子汤的质量。

表2 15批六君子汤指纹图谱相似度评价数据Tab.2 Data of 15 batches of Liujunzitang fingerprint spectrum similarity evaluation

2.5.4 六君子汤指纹图谱聚类分析

釆用样品聚类分析法，使用组间平均连接统计量，以欧氏(欧几里得)距离作为度量方式，对15批含有不同陈化年份、不同产地陈皮的六君子汤进行聚类分析，结果见图9。

图9 15批含有不同陈化年份、产地陈皮的六君子汤指纹图谱聚类分析结果Fig.9 Cluster analysis results of fingerprints of 15 batches of Liujunzi Decoction containing Citri Reticulatae Pericarpium of different ageing years and origins

由聚类分析所得到的树状图分析可知：可将15批含有不同陈化年份、不同产地陈皮的六君子汤分为3大类，一类为S1～S8和S11、一类为S13和S14，一类为S9～S10、S12和S15。其中，在第一大类中，又可分为S3和S4、S7和S8、S5和S11这3小类。

3 讨论

前期文献研究及实验表明，陈皮中的黄酮类成分可能是发挥胃肠道作用的主要物质，且由于陈皮中生物碱类成分较少，而挥发油在煎煮过程中其有效成分可能会挥发。综合考虑，对含有不同陈化年份、不同产地陈皮的六君子汤进行了指纹图谱及方法学考察，实验前期考察了不同洗脱比例的洗脱能力，发现洗脱比例为0～10 min 90%(A)、10～50 min 90%～78%(A)、50～60 min 78%～72%(A)、60～95 min 72%～42%(A)、95～100 min 42%～90%(A)时，目标峰更加清晰，峰型好，分离效果佳，无拖尾现象，基线平稳。结果表明，波长为300 nm、柱温30℃、流速1.0 mL下，色谱峰峰形较好，满足要求，在此条件下采用国家药典委员会推荐的中药指纹图谱相似度计算软件(中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版)建立得到15批含有不同陈化年份、不同产地陈皮药材六君子汤的HPLC指纹图谱及其对照图谱，在共有模式图谱中对其中陈皮黄酮的特征峰进行指认。通过不同批次的六君子汤的指纹图谱量化数据特征峰的数据可以看出，各成分色谱峰的相对保留时间基本没有变化，RSD%均小于1.0%，但是相对峰面积变化非常显著，提示不同陈化年份、不同产地的药材成分含量存在着差异，因此，推测其发挥胃肠道调节及胃肠道免疫作用亦有所差异。

从聚类分析结果可知，S1～S6是一大类，且其产地都为东甲，表明陈皮来源对质量的影响较大；S9、S10、S12聚为一类，且其陈化年份都较短，表明陈皮陈化年份对质量影响较大；由于S12与S11没有聚为一类，而它们都为陈化4年的陈皮，不同点是品种稍有差异，S11为大红皮，S12为微红皮，可知采摘月份可能对陈皮质量有一定的影响，但具体结果还应与药效数据相互结合进行综合分析。

本研究旨在建立不同产地陈皮的特征指纹图谱，并进行相似度分析及聚类分析，为“要补气，先理气”的组方原理与中医思想的传承提供科学依据，从新的视角合理阐释理气作用与补气作用相互依存的科学实质，为临床用药和新药研究提供指导。