酿酒酵母发酵提取罗马洋甘菊活性成分研究

牛 浩，王鹏宇，于金澎，隋丽媛

(佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

研究表明，多酚和黄酮具有良好的清除超氧阴离子、DPPH自由基的能力[1]，且具有抗菌、抗炎等功效[2]。近年来，人们更注重安全健康，食品、药品、化妆品中越来越多地加入天然植物成分，以达到环保和健康的要求。罗马洋甘菊中含有天然的多酚和黄酮等抗氧化剂[3]，目前提取罗马洋甘菊成分大多采用乙醇提取法，但采用乙醇提取技术得到的成分应用于化妆品原料中出现了溶解性差、生物利用度低等问题。

微生物发酵是一种传统的提取方法，已广泛应用于中药材和天然植物的提取，并应用于医药、食品、化妆品等领域[4]。微生物发酵提取天然植物能显著影响植物提取物的功效，富集有效成分，增加如黄酮类、萜内酯等有效成分的含量[5]，同时解决了有效成分溶解性差和生物相容度低的问题。基于此，利用酿酒酵母发酵提取罗马洋甘菊的总多酚和总黄酮，考察不同因素对成分提取率的影响，得到较优的实验提取工艺条件，为罗马洋甘菊活性成分的提取提供了新的思路和方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

721G 紫外分光光度计(上海精科有限公司生产)、培养箱(美墨尔特贸易有限公司生产)、酿酒酵母(北纳生物生产)、罗马洋甘菊(黑龙江佳木斯种植生产)、pH计(上海仪电科学生产)。

1.2 标准曲线的绘制

芦丁标准曲线：精密称取干燥的芦丁标准品，用60%乙醇稀释至相应浓度，依次加入5%的NaNO2溶液、10% Al(NO3)3溶液和4%NaOH溶液，室温下避光静置15 min，测量在510 nm下样品溶液吸光度，平行测定3组。以芦丁浓度为横坐标，以不同浓度所对应的吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准曲线。

没食子酸标准曲线：精密称取干燥的没食子酸标准品，用蒸馏水稀释至相应浓度，分别加入福林酚试剂，2 mL 20%的碳酸钠溶液，混匀，避光反应10 min，测量在765 nm下样品的吸光度，平行测定3组。以没食子酸浓度为横坐标，以不同浓度所对应的吸光度为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线。

1.3 酿酒酵母发酵提取罗马洋甘菊活性成分试验

接菌量影响试验：配制溶液，灭菌后放凉，待用。分别按照不同接菌率，接入酿酒酵母，28℃培养箱中发酵3 d。

发酵时间影响试验：按照上述实验确定的接菌率配制溶液，置于28℃培养箱中分别培养不同天数。

料液比影响试验：配制不同料液比溶液，灭菌后放凉，待用。按照上述实验确定的接菌率，接入酿酒酵母，置于28℃培养箱中培养3 d。

1.4 发酵液中总黄酮和总多酚提取率的计算

将得到的发酵液离心，按照绘制芦丁标准曲线和没食子酸标准曲线的实验步骤分别测定上清液在510 nm和765 nm下吸光度，再分别代入芦丁标准曲线和没食子酸标准曲线中，计算发酵液中总黄酮和总多酚的提取率。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

芦丁标准曲线和没食子酸标准曲线如图1所示。结果显示，芦丁浓度在0.2～1 mg/mL、没食子酸浓度在20～80 μg/mL均呈良好的线性关系，可以用于提取物中总黄酮和总多酚含量的计算。

图1 标准曲线 a:芦丁标准曲线；b:没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve a: rutin standard curve; b: gallate standard curve

2.2 接菌率对发酵液中总黄酮和总多酚提取率影响的分析

实验考察了不同接菌率对发酵液中总黄酮和总多酚提取率的影响，其结果如图2所示。

从图2中看到，随着酿酒酵母接菌率的增加，发酵液中总多酚和总黄酮的提取率先升高后降低，接菌率8%时，两种成分的提取率均达到最高，总黄酮提取率为12.77%，总多酚提取率为7.66%。出现这种情况的原因可能是因为随着酿酒酵母接菌率的提高，发酵体系中的营养物质不能满足酿酒酵母维持自身生长所需的能量，使得酿酒酵母活力降低，导致两种成分的提取率下降。

图2 接菌率对发酵液中总黄酮和总多酚提取率影响Fig.2 Effect of inoculation rate on extraction rate of total flavonoids and total polyphenols in fermentation broth

2.3 发酵时间对发酵液中总黄酮和总多酚提取率影响的分析

实验考察了不同发酵时间对发酵液中总黄酮和总多酚提取率的影响，其结果如图3所示。

图3 发酵时间对发酵液中总黄酮和总多酚提取率影响Fig.3 Effects of fermentation time on extraction rates of total flavonoids and total polyphenols in fermentation broth

从图3中看到，随着发酵天数的增长，总黄酮的提取率先升高后降低，发酵时间为3 d时总黄酮提取率最高，达到12.65%。总多酚的提取率同样在发酵3 d时最高，达到7.76%。随着发酵天数的增长，总多酚提取率略有降低，推测是因为发酵3 d时酿酒酵母的生命活力最强，随着发酵时间的增长，体系中的营养物质已不能满足维持酿酒酵母自身生长所需的能量，使得酿酒酵母活力降低，导致两种成分的提取率下降。

2.4 料液比对发酵液中总黄酮和总多酚提取率影响的分析

实验考察了不通过料液比对发酵液中总黄酮和总多酚提取率的影响，其结果如图4所示。

图4 料液比对发酵液中总黄酮和总多酚提取率影响Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on extraction rates of total flavonoids and total polyphenols in fermentation broth

从图4中看到，随着料液比的增大，总黄酮的提取率先升高后降低，在料液比1∶2时，总黄酮提取率最高为11.63%，在料液比1∶1.5时，总多酚提取率最高为6.47%，两种成分的提取率随着料液比的增加，均有明显的下降，可能是由于料液比变化，使得分子扩散速率改变，从而影响提取率。

3 结语

通过酿酒酵母发酵提取罗马洋甘菊的研究，发现接菌率、发酵时间和料液比因素对发酵液的总黄酮和总多酚的提取率均有影响，其中发酵时间和料液比对提取率的影响较明显。该研究为建立酿酒酵母发酵提取罗马洋甘菊的工艺提供了基础。