补骨脂二氢黄酮对神经胶质瘤细胞增殖、迁移、凋亡及ABCE1表达的影响*

吴岳珊，常 婧，葛娟娟，徐康彦，刘 溪，周 权，朱 薿，胡美纯**

(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院医学部基础医学院)

胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是恶性的原发性神经胶质瘤，在人类所有类型肿瘤中致死率排名前十。目前GBM的治疗方法以手术治疗加放疗、化疗为主。但因GBM具有弥漫性，手术治疗难以完全切除，导致GBM患者易复发，生存预后较差，死亡率较高，严重影响全球人民的生命健康。因此，开发新的靶向治疗GBM药物刻不容缓。补骨脂二氢黄酮(bavachin)是一种存在于补骨脂的黄酮类化合物，具有抗肿瘤活性，能有效抑制肝癌、骨肉瘤、绒毛膜癌等肿瘤细胞的生长，但其是否对GBM有抑制作用尚不清楚。本研究通过体外实验研究不同浓度的补骨脂二氢黄酮对人胶质母细胞瘤的抑制作用，并初步探索其作用机制，为后续的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

补骨脂二氢黄酮(CAS号：19879-32-4)购自上海源叶生物科技有限公司。人胶质母细胞瘤细胞(U87MG细胞)和人胶质瘤细胞(U251细胞)为本实验室保存。DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司。CCK-8试剂盒(BS350B)购自中国Biosharp公司，AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(C1067M)，Western及IP细胞裂解液(P0013)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)、Western封闭液(P0023B)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)、超敏ECL化学发光试剂盒(P0018S)均购自碧云天生物技术公司。Page Ruler Prestained Protein Ladder(26616)购自美国Thermo公司。GAPDH Rabbit pAb(AC001)购自ABclonal公司、ABCE1 Rabbit pAb(389078)购自ZENBIO公司。HRP标记山羊抗兔IgG(AS014)购自ABclonal公司。OLYMPUS倒置荧光显微镜(型号IX73)。ESCO CO2培养箱(CCL-170T-8)。BioTek全自动酶标仪(SYNERGY/HIX)。显影仪(IBright 1500)购自美国Invitrogen公司。Mini Trans-Blot Electrophoret转印槽、Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直电泳系统、PowerPacBasic电泳电源、Mini-Sub Cell GT Cell水平电泳槽购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖实验

采用CCK-8法检测细胞增殖。取对数生长的U87MG细胞，调整细胞悬液浓度为6×104/mL，接种于96孔板，细胞长至70%时，分别将终浓度为0、1、5、10、20、50μmol/L的补骨脂二氢黄酮培养液加入细胞中，于37℃，5% CO2培养箱中培养48h。向每孔加入10μL的CCK-8溶液，避光孵育1h，用酶标仪在450nm波长处检测吸光值(A)，细胞存活率=A药物组/A对照组×100%，用GraphPad Prism 8描绘细胞生长曲线，并计算出IC50值(实验重复3次，下同)。

1.2.2 细胞划痕实验

采用划痕实验检测细胞迁移能力。取对数生长的U87MG细胞，以每孔5×105个细胞接种于六孔板，待细胞长至95%时，划痕并用PBS冲洗，加入2mL终浓度为2.5、5μmol/L的补骨脂二氢黄酮培养液，培养48h，并在0h、48h进行拍照观察。通过Image J测量细胞迁移面积(S)，细胞迁移率=(S对照组-S药物组)/S对照组×100%，以此分析细胞伤口愈合面积。

1.2.3 AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测

采用AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测细胞凋亡。取对数期生长的U87MG细胞，以每孔1×105个分别接种于24孔板中，待细胞生长至70%时，弃去原培养液，分别加入终浓度为5、10、20μmol/L的补骨脂二氢黄酮的培养液，培养48h后，用PBS洗涤1次，避光依次加入Annexin V-FITC结合液、Annexin V-FITC、碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色液，轻轻混匀。在室温、避光孵育10～20min，OLYMPUS倒置荧光显微镜下观察，拍照。细胞Annexin V-FITC染色呈阳性，PI呈阴性的，为早期凋亡细胞；Annexin V-FITC和PI染色均呈阳性的，为晚期凋亡、坏死或死亡的细胞；细胞AnnexinV-FITC和PI染色均为阴性的，为活细胞。通过Image J软件分析荧光数量，统计荧光出现的数量，观察细胞凋亡程度。

1.2.4 蛋白检测

采用Western blot法检测ABCE1蛋白的表达水平。收集补骨脂二氢黄酮作用48h的U87MG细胞及对照组细胞，PBS洗涤，加入150μL细胞裂解液，冰上裂解30min，12 000g，4℃离心15min，弃沉淀，上清液即为细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。根据Western blot法步骤配置10%SDS-PAGE凝胶，恒压(80v，120min)电泳，恒流(275mA，90min)转膜，Western封闭液封闭1h及一抗4℃过夜孵育、二抗室温孵育1h、ECL液显影及成像拍照等操作，用Image J软件进行分析。检测ABCE1的表达水平，以ABCE1的灰度值/GAPDH的灰度值，计算ABCE1蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 补骨脂二氢黄酮抑制U87MG细胞增殖

将0、1、5、10、20、50μmol/L的补骨脂二氢黄酮作用于GBM细胞，通过CCK-8法检测U87MG细胞增殖情况。补骨脂二氢黄酮以作用于U87MG细胞48h后，与对照组相比，各组细胞存活率分别为90.62%、74.75%、48.69%、34.69%、19.31%，IC50值为11.18μmol/L。实验结果发现补骨脂二氢黄酮能有效抑制U87MG细胞的增殖，并且这种抑制效应呈现剂量依赖性(图1)。

图1 补骨脂二氢黄酮对U87MG细胞增殖的影响(n=3)

2.2 补骨脂二氢黄酮抑制U87MG细胞迁移

采用划痕实验验证补骨脂二氢黄酮对GBM细胞迁移的抑制作用。补骨脂二氢黄酮以25、5μmol/L浓度作用于U87MG细胞48h，与对照组相比，各组细胞迁移率分别为52.28%、18.41%。结果表明随着补骨脂二氢黄酮药物浓度的增加，U87MG细胞迁移能力显著降低(图2)。

与对照组相比，**P<0．01，n=3

2.3 补骨脂二氢黄酮诱导U87MG细胞凋亡

采用Annexin V-FITC/PI染色法观察细胞凋亡情况。结果所示，随着补骨脂二氢黄酮浓度的增加，PI标记红色荧光和Annexin V-FITC标记绿色荧光的数量逐渐增多(图3)。结果表明补骨脂二氢黄酮可诱导U87MG细胞凋亡。

与对照组相比，**P<0.01，n=3

2.4 补骨脂二氢黄酮对ABCE1蛋白表达的影响

采用WB法观察不同浓度补骨脂二氢黄酮处理U87MG细胞48h后ABCE1蛋白表达情况，结果发现补骨脂二氢黄酮作用的U87MG细胞中ABCE1表达呈剂量依赖性下调(图4)。

与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，n=3

3 讨 论

GBM是一类具有侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，治疗困难，易复发，死亡率高[1]。目前用于GBM治疗的化疗药易产生耐药性以及难以穿透血脑屏障。研究发现补骨脂二氢黄酮属于戊烯基黄酮，较容易进入大脑并在脑核中蓄积，在口服给药72h后，脑组织中仍可检测到[2]。这表明补骨脂二氢黄酮使得GBM治疗药物成为可能。本研究证实补骨脂二氢黄酮可以抑制GBM增殖和迁移，提示补骨脂二氢黄酮可以作为治疗GBM的潜在药物。

补骨脂二氢黄酮是一种来自补骨脂的黄酮类化合物。果实入药，有补肾壮阳、补脾健胃之功能，并可治牛皮癣等皮肤病。研究[3]发现，补骨脂二氢黄酮能通过下调AMPK/mTORC1通路诱导肝癌HepG2细胞的内质网应激，还通过抑制骨肉瘤细胞中的STAT3/P53/SLC7A11通路诱导肿瘤细胞发生铁死亡[4]，并通过激活caspase途径诱导绒毛膜癌细胞的线粒体依赖性细胞凋亡[5]。总之，补骨脂二氢黄酮通过上述多种机制发挥其抗肿瘤功效。但还没有研究表明补骨脂二氢黄酮对GBM具有抑制作用。本研究通过将不同浓度补骨脂二氢黄酮作用于人胶质瘤细胞系，观察到其对GBM具有抑制作用，并具有浓度依赖性。同时发现，人神经胶质瘤细胞U87MG经补骨脂二氢黄酮处理，可通过凋亡机制抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。

ABCE1基因是一种调控基因，它对于细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡均有一定的调控作用。有研究[6]表明，通过FOXO3a/Parkin/ABCE1通路，ABCE1能有效调控胃癌细胞的增殖迁移和凋亡。ABCE1与乳腺癌、肺癌、结肠癌及直肠癌等多种恶性肿瘤密切相关，其在肿瘤中的表达高于正常组织[7]。本研究发现U87MG细胞在补骨脂二氢黄酮处理后，细胞中ABCE1蛋白的表达有明显下调趋势，表明补骨脂二氢黄酮对ABCE1有抑制作用，且具有浓度依赖性。由此可见补骨脂二氢黄酮可能通过调控ABCE1诱发GBM细胞凋亡。

综上所述，补骨脂二氢黄酮能够有效抑制人神经胶质瘤细胞的增殖和迁移，同时通过调控ABCE1表达诱导细胞凋亡，证实补骨脂二氢黄酮具有抑制人神经胶质母细胞瘤的潜力。本研究主要集中在各项体外细胞实验，今后有必要进一步进行体内动物实验验证补骨脂二氢黄酮对人神经胶质母细胞瘤的抑制作用及其机制，为补骨脂二氢黄酮的临床应用提供理论依据。