银杏叶提取物对PM2.5致大鼠急性肺损伤的作用研究*

吴 喆，孙燕玲，林 丽

(湖北科技学院医学部基础医学院，湖北 咸宁 437100)

流行病学资料表明，大气细颗粒物(PM2.5)可产生急性与慢性健康效应，急性健康效应主要体现为高PM2.5暴露可增加急性呼吸道疾病与心脑血管疾病的患病风险，慢性健康效应主要体现为PM2.5可能诱发肺癌、慢性阻塞型肺炎、心脑血管疾病等慢性疾病[1]。目前，尚未有较好的措施用于防治PM2.5暴露对人体呼吸系统的损害。银杏叶用作药物在我国已有悠久的历史，银杏叶提取物是目前临床使用范围最广泛的植物提取物之一，对于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞、脑栓塞等心脑血管疾病和呼吸系统疾病具有显著的疗效[2]。因此，本实验采用气管滴注PM2.5建立急性肺损伤模型，通过观察银杏叶提取物Egb761对PM2.5暴露所致急性肺损伤的影响，为防治大气颗粒物污染导致的呼吸系统疾病提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级健康Wistar大鼠30只，雌性，5～6周龄，体质量130～150g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，动物合格证号：No.211002300050341。在温度24℃～28℃，湿度40%～50%的清洁环境中饲养，昼夜节律为12h。

1.2 试剂与仪器

EGb761(40mg/粒)由法国博福-益普生制药工业公司生产；PM2.5悬液制备：用大流量采样器对大气细颗粒物进行采集，将收集到的PM2.5玻璃纤维滤膜剪成小块，在超纯水中超声震荡40min脱颗粒，用无菌纱布进行过滤，滤液以2 200r/min、4℃离心10min，收集底部沉淀，-80℃冷冻24h，真空干燥后低温保存。实验前，将冻干的颗粒物质与0.9%氯化钠溶液混合成颗粒悬液，超声振荡15min，保证悬液均匀、无菌。

KC-1000型大流量TSP采样器(青岛崂山电子仪器总厂有限公司)，3K15高速冷冻离心机(德国Sigma实验室离心机公司)，SpeedVacTMSRF110真空离心浓缩仪(美国Thermo Fisher科技有限公司)，DHG-9123A台式电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，BAS124S电子天平(德国Sartorius集团)，CH2生物显微镜(日本Olympus株式会社)，AniRes2005动物肺功能分析系统(北京贝兰博科技有限公司)，RM2245石蜡切片机(德国Leica仪器有限公司)。

1.3 动物模型及分组

采用随机数字表法将大鼠分为3组，分别为对照组、PM2.5组及Egb761组，每组10只。PM2.5组与Egb761组以1mL/kg体质量为滴注体积经气管滴注PM2.5悬液(10mg/mL)染毒，对照组经气管滴注相同体积的0.9%氯化钠溶液，1次/48h，连续4周。Egb761组自染毒之日开始经灌胃给予浓度为10mg/mL的Egb761溶液，对照组与PM2.5组给予0.9%氯化钠溶液，灌胃体积为1mL/100g体质量，1次/d，连续4周。

1.4 给药与染毒方法

采用气管滴注的方法染毒：腹腔注射10%水合氯醛(0.4mL/100g)麻醉大鼠，将大鼠仰卧固定于手术台上，使大鼠头部与颈部成一条直线，用镊子将大鼠舌头夹住后轻轻拉出口腔，下压舌根，用无菌棉签擦拭大鼠咽喉部的分泌物，将12号灌胃针沿舌根插入，感到阻力后继续轻柔伸入，尽量插深，滴注一定体积的PM2.5悬液，若听见大鼠呼吸湿性啰音，说明滴注成功，拔出灌胃针，将大鼠仰卧位放置直至苏醒。

采用经口灌胃的方法给药：左手固定大鼠，使头部和颈部保持一条直线，右手持16号灌胃针从大鼠一侧嘴角轻柔插入，灌胃针沿大鼠咽后壁进入食道，插入大鼠食道深度一般为4～6cm，缓慢注完药液后轻轻抽出灌胃针。

1.5 观察指标

1.5.1 一般体征观察

每周最后一天观察并记录大鼠体质量、生存状态、呼吸运动和活动度，绘制体质量增长曲线并分析其变化规律。

1.5.2 肺功能检测

使用AniRes2005动物肺功能分析系统通过气管切开插管检测肺功能。最后1次染毒48h后用10%水合氯醛(0.4mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠的四肢和头部，颈部备皮后纵行剪开颈部皮肤、肌层和筋膜，钝性分离颈前肌群等组织，暴露气管，在气管近头端行T字形切口，用内径2mm的气管导管插管，棉线固定后转移至体描箱，连接小动物呼吸机与气管接头，记录大鼠呼气阻力(Re)、吸气阻力(Ri)和气道顺应性(Cldyn)的变化。

1.5.3 W/D与肺系数测定

称取体质量，最后1次染毒48h后处死大鼠，取右肺前叶，用滤纸蘸干表面水分，称重后记为湿重，70℃恒温干燥箱中干燥48h后再次称重，记为干重，计算湿重/干重(W/D)；取右肺后叶称重，计算肺系数(肺重/体质量)。

1.5.4 肺组织形态学观察

取左肺，4%多聚甲醛溶液固定24h，用乙醇溶液梯度脱水、二甲苯透明，石蜡包埋后用切片机制成厚度约5μmol/L的切片，行HE染色，封片后在光学显微镜下观察肺组织的形态学变化。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠一般体征的比较

与对照组相比，PM2.5组大鼠体质量增长缓慢，毛发光泽度较差，呼吸略急促，活动减少；Egb761组大鼠与PM2.5组相比体质量增长平稳，毛发光泽度较好，呼吸基本正常，活动明显增加，见图1。

与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01(n=10)

2.2 各组大鼠肺功能指标的变化

与对照组相比，PM2.5组大鼠呼气阻力和吸气阻力明显增加(P<0.05)，气道顺应性显著下降(P<0.05)；Egb761组的呼气阻力和吸气阻力均明显小于PM2.5组(P<0.05)，气道顺应性明显增高(P<0.05)，见图2。

与正常组比较，**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01(n=10)

2.3 各组大鼠肺组织W/D和肺系数结果比较

与对照组相比，PM2.5组W/D高于对照组(P<0.05)，肺系数也明显升高(P<0.05)；Egb761组的W/D明显低于PM2.5组(P<0.05)，肺系数也有所降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠湿干重比和肺系数比较

2.4 各组大鼠肺组织病理学变化

对照组大鼠肺组织结构清晰完整，各级支气管肺泡未见炎性细胞浸润、渗出、充血、水肿等；PM2.5组肺组织有大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，部分肺泡壁间断相连呈现不规则塌陷状，肺泡腔内有渗出，肺泡隔充血水肿、明显增宽；Egb761组肺组织有少量炎细胞浸润，各级支气管及肺泡结构较清晰完整，肺泡壁略增厚，肺泡腔内渗出和肺泡隔充血水肿程度较轻。见图3。

图3 各组大鼠肺组织形态学变化(HE染色，×100)

3 讨 论

研究表明[1]，大气颗粒物(PM)严重影响人体健康和大气环境质量，颗粒物粒径越小对人体的危害越大。PM2.5是一种可入肺颗粒物，其空气动力学当量直径小于或等于2.5μmol/L，由于粒径小，在大气中停留的时间长，可吸附细菌、芽孢、病毒和真菌等有毒有害物质，大量PM2.5随呼吸气流进入呼吸道后沉积于各级支气管和肺泡内，作用于肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞，刺激炎性因子释放，诱导全身及局部炎症反应，导致急性肺损伤[3]。本研究通过气管滴注PM2.5染毒，与对照组比较，滴注PM2.5的大鼠体质量增长缓慢，毛发光泽度较差，呼吸略急促，活动减少，提示PM2.5暴露能够抑制大鼠的正常生长和活动。W/D是反映脏器水肿度的指标，W/D越高说明脏器水肿度越高，脏器系数则能反映脏器的增生或萎缩情况[4]，本实验中PM2.5组W/D高于对照组，肺系数也明显升高，表明PM2.5染毒可能导致肺部水肿，使肺重量增加。炎症反应是呼吸系统疾病发生的主要机制[5]，本研究形态学结果显示，气管滴注PM2.5后，肺组织有大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，部分肺泡壁间断相连呈现不规则塌陷状，肺泡腔内有渗出，肺泡隔充血水肿、明显增宽，说明PM2.5暴露可引起肺组织的炎症反应，导致急性肺损伤。

银杏叶提取物是从银杏干燥叶中提取出的具有药理活性的化合物，成分主要为黄酮类及银杏内脂等。目前银杏叶提取物主要用于心血管系统和中枢神经系统疾病的治疗，其作用机制为保护血管和各种组织、增强认知能力、应激反应缓释作用以及基因调节作用，对脑机能不全、痴呆、外周血管病等均有较好的疗效[6]。银杏叶提取物的有效成分具有多价性，随着基础或临床研究的不断深入，其应用范围也在逐渐扩大，研究[7-8]证实银杏叶提取物可用于治疗慢性阻塞性肺炎和肺纤维化等呼吸系统疾病。本实验PM2.5染毒大鼠在应用银杏叶提取物Egb761后体质量增长平稳，毛发光泽度较好，呼吸基本正常，活动明显增加，提示Egb761在一定程度上可拮抗PM2.5暴露所导致的生长抑制作用；Egb761组的W/D明显低于PM2.5组，肺系数也有所降低，表明Egb761可减轻PM2.5引起的肺水肿；形态学结果显示，与PM2.5组相比，Egb761组肺组织有少量炎细胞浸润，各级支气管及肺泡结构较清晰完整，肺泡壁略增厚，肺泡腔内渗出和肺泡隔充血水肿程度较轻，说明Egb761可减轻肺组织的炎症反应，有效缓解PM2.5暴露所致的急性肺损伤。

研究[9]表明，PM2.5对数浓度每增加1个单位，呼吸系统出现症状的危险性增加1.79倍，每上升10μg/m3，肺功能指标下降26mL。肺功能检测是呼吸系统疾病的必要检查项目之一，可对通气功能、换气功能、呼吸调节功能及肺循环功能等进行评价。Re和Ri能较好地反映呼吸道的通气功能，协助判断肺通气功能减退的原因，Cldyn是呼吸周期中气流未阻断时测得的肺顺应性，对小气道阻力敏感性较高[10]。本研究结果显示，PM2.5组大鼠呼气阻力和吸气阻力较对照组明显增加(P<0.05)，气道顺应性显著下降(P<0.05)；Egb761组的呼气阻力和吸气阻力均明显小于PM2.5组(P<0.05)，气道顺应性则明显增高(P<0.05)，提示Egb761可以改善PM2.5所导致的肺损伤，降低肺损伤大鼠的通气功能障碍，尤其是小气道功能障碍，提高肺顺应性。

综上所述，Egb761可拮抗PM2.5造成的生长抑制，减轻肺水肿和肺组织的炎症反应，改善肺脏通气功能，提高肺顺应性，能有效缓解PM2.5暴露所致的急性肺损伤，但Egb761减轻肺组织炎症反应的作用机制尚需深入探讨，我们将以此为目标来开展下一步的研究。