北五味子多糖对缺氧/复氧心肌细胞氧化应激损伤的保护作用

刘 蕾，赵雪东，王智彬

急性心肌梗死是临床常见的缺血性心血管疾病类型，近年来，缺血性心血管疾病发生率及死亡率逐年增加，严重威胁人类生命。临床采用冠状动脉介入等方式治疗急性心肌梗死，但心肌再灌注导致心肌缺血再灌注损伤发生[1-2]。目前关于心肌缺血再灌注损伤的分子机制尚未明确。有研究显示，九龙藤总黄酮等中医药具有抗氧化、抗炎等作用[3]，但关于中医药对心肌细胞氧化损伤的作用机制尚未明确。五味子是我国传统中药，具有补肾宁心、益气生津的功效，其中北五味子多糖(schisandra chinensis polysaccharide，SCP)具有抗氧化、增强免疫力、抗肿瘤等作用，有研究表明，SCP可抑制促炎因子释放，抑制炎症反应[4]。但SCP对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)心肌细胞氧化损伤的作用机制尚未明确。巨噬细胞中微小RNA(microRNA，miR)-212-3p表达下调，miR-212-3p通过靶向调控高迁移率族蛋白B1(HMGB1)抑制脂多糖诱导的炎症反应[5]。生物信息学分析显示，10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)可能是miR-212-3p的靶基因，抑制PTEN表达可抑制H/R诱导的星形胶质细胞凋亡[6]。本研究通过分析SCP对H/R诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激损伤的影响，分析对miR-212-3p/PTEN分子轴的调控作用，为SCP治疗急性心肌梗死等心血管疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 SCP购自秦皇岛旭光生物科技有限公司，采用二氧化碳瘤体萃取SCP，分离水溶性成分与脂溶性成分，应用超声波搅拌，超声波预处理40 min后浸润，采用酶法与三氯乙酸结合脱蛋白得到SCP，提取有效率为77.6%，纯度为50%[7]。大鼠心肌细胞H9c2由深圳市百恩维生物科技有限公司提供；miR-212-3p mimics、anti-miR-212-3p、miR-NC、anti-miR-NC由广州锐博生物科技有限公司提供；兔抗鼠PTEN抗体由北京百奥莱博科技有限公司提供；兔抗鼠Bax、Cleaved Caspase-3抗体均由美国Santa Cruz公司提供；山羊抗兔二抗由美国Abcam公司提供；凋亡试剂盒由美国Sigma公司提供；Trizol试剂、反转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒均由北京天根生化科技有限公司提供；乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。Lipofectamine 2000由美国Invitrogen公司提供。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 心肌细胞用含10%胎牛血清的培养基在常规培养箱(37 ℃、5%CO2、95%空气)中培养，胰酶消化80%融合细胞，之后以每孔150 μL接种96孔板，加入预先用95%N2与5%CO2饱和过的不含血清的培养基，细胞置于厌氧培养箱(95%N2和5%CO2)中缺氧处理2 h，弃孔内培养基，更换为含血清培养基，将细胞置于常规培养箱内复氧处理4 h[8]，作为H/R组。正常培养细胞作为Con组。分别使用25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的SCP对心肌细胞进行24 h的处理[9]，同时进行H/R处理，依次作为H/R+SCP-L组、H/R+SCP-M组、H/R+SCP-H组。分别将anti-miR-NC、anti-miR-212-3p转染至心肌细胞后加入100 μg/mL SCP处理心肌细胞24 h，并进行H/R处理，分别作为H/R+SCP-H+anti-miR-NC组、H/R+SCP-H+anti-miR-212-3p组。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡率 将转染后的心肌细胞常规接种，并按上述分组方法进行处理，常规培养并收集细胞1.0×106个，使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行2次清洗，与500 μL细胞悬液混匀，并依次加入5 μL染色液(Annexin V-FITC)及碘化丙啶(PI)，混匀后避光孵育15 min，应用流式细胞仪严格按照凋亡试剂盒操作说明对细胞凋亡情况进行分析。

1.2.3 氧化应激指标LDH、SOD、MDA含量检测 收集各组心肌细胞培养上清液，按照LDH试剂盒说明加入相应试剂，应用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值，计算LDH含量。取对数生长期心肌细胞，调整细胞密度为5×105个/mL，接种于培养皿(100 mm×20 mm)，室温孵育24 h，按照1.2.1分组处理后，弃上清液，加入0.25%胰蛋白酶消化，离心后收集细胞，根据试剂盒步骤检测细胞SOD活性、MDA含量。

1.2.4 RT-qPCR检测细胞miR-212-3p、PTEN mRNA表达水平 按上述分组方法进行处理，Trizol法常规提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明将RNA反转录合成cDNA，并配置RT-qPCR反应体系，按照荧光定量试剂盒使用说明完成PCR，以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算miR-212-3p、PTEN mRNA相对表达量。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测miR-212-3p的靶基因 starBase证实PTEN与miR-212-3p有结合位点。常规构建野生型及突变型PTEN的荧光素酶载体WT-PTEN及MUT-PTEN，并将其分别与miR-NC、miR-212-3p mimics共转染至心肌细胞，转染24 h后，严格依据说明完成细胞相对荧光素酶活性的检测。

1.2.6 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测PTEN、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达 心肌细胞常规加入RIPA裂解液完成细胞总蛋白的提取。蛋白变性后进行十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，常规进行转膜、封闭2h，依次常规加入一抗稀释液(1∶1 000)，孵育、洗膜，加入二抗稀释液(1∶5 000)，孵育、洗膜。加入电化学发光液(ECL)，暗室显影、拍照，以GAPDH为内参，应用Image J软件分别对各蛋白条带灰度值进行分析。

2 结 果

2.1 SCP对H/R诱导的心肌细胞凋亡的影响 H/R组细胞凋亡率及Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平高于Con组(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+SCP-L组、H/R+SCP-M组、H/R+SCP-H组细胞凋亡率及Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)。详见图1、表1。

图1 SCP对H/R诱导的心肌细胞凋亡的影响(A为各组细胞凋亡流式细胞图；B为各组Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达条带图)

表1 SCP对H/R诱导的心肌细胞凋亡、Bax及Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响(±s)

2.2 SCP对H/R诱导的心肌细胞氧化应激指标的影响 H/R组心肌细胞LDH、MDA含量高于Con组(P<0.05)，SOD含量低于Con组(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+SCP-L组、H/R+SCP-M组、H/R+SCP-H组心肌细胞LDH、MDA含量降低(P<0.05)，SOD含量升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。详见表2。

表2 SCP对H/R诱导的心肌细胞氧化应激指标的影响(±s)

2.3 SCP对H/R诱导的心肌细胞miR-212-3p、PTEN mRNA表达量的影响 H/R组心肌细胞miR-212-3p相对表达量低于Con组(P<0.05)，PTEN mRNA相对表达量高于Con组(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+SCP-L组、H/R+SCP-M组、H/R+SCP-H组心肌细胞miR-212-3p相对表达量升高(P<0.05)，PTEN mRNA相对表达量降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性。详见表3。

表3 SCP对H/R诱导的心肌细胞中miR-212-3p、PTEN mRNA表达量的影响(±s)

2.4 miR-212-3p靶向调控PTEN的影响 starBase预测显示PTEN的3′UTR中含有与miR-212-3p互补的核苷酸序列，详见图2。miR-212-3p过表达导致WT-PTEN荧光素酶活性降低(P<0.05)，对MUT-PTEN荧光素酶活性影响差异无统计学意义(P>0.05)，详见表4。miR-212-3p组细胞PTEN蛋白水平低于miR-NC组(P<0.05)，anti-miR-212-3p组细胞PTEN蛋白水平高于anti-miR-NC组(P<0.05)。详见图3、表5。

图2 PTEN的3′UTR中含有与miR-212-3p互补的核苷酸序列

表4 miR-212-3p过表达对荧光素酶活性的影响(±s)

图3 PTEN蛋白表达条带图

表5 miR-212-3p靶向调控PTEN蛋白表达的影响(±s)

2.5 干扰miR-212-3p表达减弱SCP对H/R诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激损伤的影响 与H/R+SCP-H+anti-miR-NC组比较，H/R+SCP-H+anti-miR-212-3p组细胞凋亡率及LDH、MDA含量升高(P<0.05)，Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)，miR-212-3p、SOD含量降低(P<0.05)。详见图4、表6。

图4 干扰miR-212-3p表达能减弱SCP对H/R诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激损伤的影响(A为细胞凋亡流式细胞图；B为PTEN、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达条带图)

表6 干扰miR-212-3p表达能减弱SCP对H/R诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激损伤的影响(±s)

3 讨 论

心肌再灌注是治疗急性心肌梗死的主要手段，临床主要采用经皮冠状动脉成形术等血管再通术进行治疗，但心肌再灌注可能造成心肌细胞损伤。相关研究显示，传统中药具有抗氧化、抑制血栓形成等作用[10-12]，但其在急性心肌梗死治疗中的作用机制尚未明确。本研究探讨SCP对H/R诱导心肌细胞损伤的影响和保护机制，为急性心肌梗死等心血管疾病的治疗提供新方向。

SCP通过改善高脂血症大鼠脂质代谢从而减轻肝损伤[13]。SCP具有降血脂、保护血管内皮功能的作用，可减轻氧化应激损伤[14]。SCP可抑制异丙肾上腺素诱导的心室重构[15]。本研究结果显示，H/R可诱导心肌细胞凋亡，而SCP使H/R诱导的心肌细胞凋亡率降低，提示SCP对H/R诱导的心肌细胞凋亡具有抑制作用。心肌细胞缺氧后导致细胞内三磷酸腺苷(ATP)减少，从而促使LDH等心肌酶从胞浆内漏出，LDH活性可反映心肌损伤程度，SOD可清除体内自由基及活性氧，属于抗氧化酶类；MDA属于过氧化脂质代谢产物，其水平升高可加重氧化应激反应发生[16]。本研究结果显示，H/R可提高心肌细胞MDA含量，提高培养液LDH活性，降低SOD活性，而SCP呈剂量依赖效应降低H/R诱导心肌细胞MDA含量，提高SOD活性，并抑制培养液LDH活性，提示SCP可抑制H/R诱导的心肌细胞氧化损伤。

miR-212-3p通过下调SOX5的表达，抑制成纤维样滑膜细胞增殖，并促进细胞凋亡，从而减轻炎症反应[17]。miR-212-3p通过靶向MeCP2调节早期神经发生[18]。抑制PTEN表达可抑制败血症诱导的心肌细胞凋亡[19]。本研究结果显示，miR-212-3p可靶向结合PTEN，H/R后，心肌细胞miR-212-3p表达降低，PTEN表达升高。使用不同剂量的SCP处理后，心肌细胞miR-212-3p表达升高，PTEN表达降低，提示SCP可能通过上调miR-212-3p表达，下调PTEN表达，进而发挥抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激损伤的作用。为验证上述推测，本研究转染anti-miR-212-3p至心肌细胞，使用SCP处理后进行H/R处理，结果显示，干扰miR-212-3p表达能减弱SCP对H/R诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激损伤的保护作用。提示SCP可能通过对miR-212-3p/PTEN分子轴的调控作用，减弱H/R诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激反应。

综上所述，SCP可抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡及氧化应激损伤，作用机制可能与SCP对miR-212-3p/PTEN分子轴的调控作用有关，为SCP抗心肌细胞凋亡及氧化应激提供实验依据，同时为急性心肌梗死等心血管疾病的治疗提供新思路。