左室功能异常二尖瓣反流病人MRI影像学参数与肌脂蛋白的相关性分析

李 扬，杨 志，马 英，任 静

二尖瓣反流是左心室扩张并在Starling机制下心搏量增加，并通过左心室向低压左心房射血促进心搏量增加[1]。尽管病人存在潜在的心肌细胞收缩障碍，这些有利于稳定左室缩短动力学，提高左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)。因此，为了维持左室收缩功能和提高生存率，若病人LVEF<60%，建议进行二尖瓣成形手术[2-3]。然而，二尖瓣修复后左室收缩功能下降是一个危险因素，心肌细胞不可逆损伤机制尚未明确。目前，尚无有效的药物可降低左心室重塑过程，而慢性二尖瓣反流病人特异性左心室心肌重塑机制尚未明确[4-6]。为了探讨二尖瓣反流的分子特征，本研究分析左室功能异常二尖瓣反流病人MRI影像参数与肌脂蛋白(SLN)水平的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月—2019年2月在秦皇岛第三医院诊治的50例二尖瓣反流病人为研究组、同期纳入13名健康者为对照组，两组均接受MRI影像检查，严重单发性二尖瓣反流病人术前均行心导管插入术。本研究通过医院伦理委员会审核。

1.2 病人纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 年龄25～76岁；继发于二尖瓣退行性疾病的严重单发二尖瓣反流，建议二尖瓣矫成形手术的病人；经超声心动图/多普勒检查证实为严重的单发性二尖瓣反流；均签署知情同意书。

1.2.2 排除标准 阻塞性冠状动脉疾病(冠状动脉狭窄>50%)；主动脉瓣疾病或伴发二尖瓣狭窄的病人。

1.3 方法

1.3.1 心脏MRI 使用1.5T的MRI扫描仪(Sigma GE Healthcare，密尔沃基，WI)并优化调试为心脏磁共振成像。通过计算左心室每个短轴切片集合的等高线轮廓总和确定体积[7-9]。

1.3.2 免疫组织化学 二尖瓣反流样本来源于研究组病人手术时的心肌组织材料，正常样本由第三方实验室提供，制成5 μm厚度的石蜡切片后，在二甲苯溶液中脱蜡并在梯度稀释的乙醇中水化恢复。使用含有5%正常血清封闭后，切片用SLN抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc，CA，1∶100稀释)；室温孵育1 h后，使用Alexa荧光偶联的二抗(分子探针，Eugene，OR，1∶200稀释)再次室温孵育1 h。使用含DAPI的Vectashield Mounting培养基进行核染色计数(Vector Laboratories，Burlingame，CA)。使用预装Simple PCI软件的徕卡DM6000荧光显微镜(Compix，Inc，Cranberry Township，PA)进行图像采集和荧光强度测量。图像进行适当的背景荧光调整。

1.3.3 免疫印迹法 总蛋白匀浆液来源于对照组正常组织样本和二尖瓣反流病人组织样本。3名健康者和4例二尖瓣反流病人左心室组织样本在8%[SERCA2a和calsequestrin(CSQ)]或14% Tricine十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或16.5%甘油三醇凝胶上电泳分离，并转移到硝化纤维素膜上。使用一抗(兔抗SLN为1∶3 000，兔抗SERCA2a为1∶5 000，抗兔CSQ为1∶500)，之后是hrp偶联的二抗[10]。使用Super Signal West Dura底物(Pierce)检测信号并用密度法定量并归一化到CSQ表达水平。样品缓冲液中的蛋白首先通过考马斯亮蓝染色，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，分别对SERCA和SLN进行免疫印迹法，使用相同的样本，以CSQ和GAPDH作为内参。

2 结 果

2.1 对照组与研究组临床资料比较(见表1)

表1 对照组与研究组临床资料比较

2.2 对照组与研究组MRI影像学参数比较(见表2)

表2 对照组与研究组MRI影像学参数比较(±s)

2.3 典型病例的左心室双腔图像(见图1)

图1 典型病例的左心室双腔图像

2.4 免疫印迹法定量检测SLN表达 免疫印迹法检测显示，研究组SLN表达高于对照组。采用Super Signal West Dura底物(Pierce)检测信号并用密度法定量并归一化到CSQ表达水平发现，研究组SLN表达较对照组增加。详见图2。

图2 两组SLN蛋白表达比较(A为SLN蛋白免疫印记图像；B为SLN蛋白表达柱状图)

2.5 SLN免疫荧光染色 SLN免疫荧光染色结果显示，研究组SLN表达较对照组增高。对照组SLN染色信号强度为(245.87±20.51)，研究组为(2 570.32±513.36)，两组比较差异统计学意义(P<0.001)。详见图3。

图3 两组SLN免疫荧光染色比较(A为SLN的免疫荧光染色；B为SLN信号强度柱状图)

2.6 SLN免疫荧光染色强度与MRI影像学参数的相关性分析 对SLN免疫荧光染色强度MRI影像学参数进行相关性分析，结果显示SLN免疫荧光染色强度(2 570.32±513.36)与LVEDV、LVESV、LVSV、LVMI、LVEDD、LVESD、LVEDD(球状化指数)、LVESD(球状化指数)呈正相关。详见表3。

表3 SLN免疫荧光染色强度与MRI影像学参数的相关性分析

3 讨 论

二尖瓣反流是临床常见的心脏瓣膜疾病，病程进展可能导致肺动脉高压、心力衰竭、心房颤动等，严重者甚至死亡。SLN位于内质网膜上，是由31个氨基酸组成的蛋白质，主要在骨骼肌、心肌细胞中表达[11]。有研究显示，SLN参与乳腺癌等疾病的发生和发展，但其在心血管疾病中作用的研究较少[8，12]。SLN通常在心房中高表达，在心室中低表达或检测不到[8]。SLN在正常和病变心肌的人类或动物模型中作用差异尚不明确。

相关研究表明，SLN通过降低SERCA2a的Ca2+亲和性，发挥调节功能[9-10]。Tako-Tsubo型心肌病病人中，SLN在功能失调的左心室出现急性表达升高，并在12 d恢复期后，LVEF恢复正常[13-14]。因此，二尖瓣反流病人心脏中SLN表达增加可能是肾上腺素驱动增加的早期代偿性改变。SLN心室表达是否有害尚未明确，虽然处于较低表达水平，但保持着基础水平。

本研究结果显示，研究组与对照组LVEDV、LVESV、LVSV、LVMI、LVEDD、LVESD、LVEDD(球状化指数)、LVESD(球状化指数)比较，差异均有统计学意义。典型二尖瓣反流病人左心室双腔图像显示明显的左室扩张和心室壁变薄。通过MRI测定心室体积，病人左心室重塑程度是一致的。

本研究免疫印迹法定量检测发现，研究组SLN表达染色信号强度高于对照组，同时免疫荧光染色结果显示，研究组SLN蛋白表达较对照组增高，两组比较差异有统计学意义。本研究发现二尖瓣反流病人SLN表达上调，通常认为是心房肌细胞特异性SERCA的调节，在调节单发二尖瓣反流病人左心室功能方面具有重要的意义。本研究对SLN免疫荧光染色强度与影像学参数进行相关性分析，结果显示SLN免疫荧光染色强度与LVEDV、LVESV、LVSV、LVMI、LVEDD、LVESD、LVEDD(球状化指数)、LVESD(球状化指数)呈正相关。

综上所述，SLN作为关键的心房调节因子在左室功能异常二尖瓣反流病人中显著上调，且与MRI影像学参数具有相关性，可填补关于超负荷体积导致的心脏功能失调过程，尤其在肾上腺素增加的单发二尖瓣反流病人SLN表达。