梓醇防治骨质疏松症的研究进展

孙娜 徐蕾 隋文静 李寒 曹益国 孙慧君 李忠海, 5 田康,5 石志华 徐钢,5*

1. 大连市第三人民医院，辽宁 大连 116091

2. 大连医科大学附属第一医院，辽宁 大连 116011

3. 大连市公共卫生临床中心，辽宁 大连 116001

4. 大连医科大学，辽宁 大连 116044

5. 辽宁省骨相关疾病修复重塑分子机制重点实验室，辽宁 大连 116011

骨质疏松症常易导致骨折，致残和致死率高，严重影响患者生活质量，被世界卫生组织认定为重要的全球性健康防治课题之一[1]。中药地黄具有滋阴养血、益精填髓等功效，作为中医临床常用药之一，常常组方用于防治骨质疏松症[2-5]。梓醇(catalpol)是中药地黄的主要活性成分之一，2020版中国药典中以梓醇和毛蕊花糖苷作为地黄的鉴别内容，以梓醇和地黄苷D作为含量测定内容[6]。梓醇是一种环烯醚萜类化合物(图1)，具有抗炎和抗氧化等药理活性，能够发挥一定的抗抑郁、改善认知和保护脑细胞作用，降血糖和改善糖尿病并发症，抗肿瘤和保护心血管系统等[7]。现将梓醇防治骨质疏松症方面的研究归纳总结，为深入挖掘其抗骨质疏松作用和发现新靶点提供借鉴。

1 梓醇抗骨质疏松作用的体内实验研究

在颅骨缺损的6周雄性SD大鼠中，搭载梓醇和经梓醇干预的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的水凝胶支架能够显著提升其骨愈合能力[8]。此外，在卵巢切除8周雌性SD大鼠中，每天腹腔注射10 mg/kg梓醇，持续8周，能够减少骨丢失，增加骨小梁数量[8]。在卵巢切除联合颅骨缺损的12周雌性SD大鼠中，每天腹腔注射10 mg/kg梓醇，持续8周，能够促进骨再生和血管形成[9]。在高脂饲料联合链脲佐菌素(STZ)诱导8周雌雄各半Wistar大鼠糖尿病骨质疏松模型中，含有梓醇等的熟地黄可以调节血清碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)水平，提高骨密度，改善骨微结构[10]。在高脂饲料联合STZ诱导7周雄性ICR小鼠糖尿病骨质疏松模型中，每天分别灌胃梓醇30、90 mg/kg，持续12周，能够减少骨小梁结构的退行性改变，从而显著改善骨小梁恶化，影响ALP、I型胶原蛋白和OCN等骨形成标志物水平以及OPG/RANKL水平[11]。

在尼古丁诱导5周雄性Wistar大鼠牙槽骨损伤模型中，皮下注射2 μg/kg梓醇，持续14 d，能够减少骨质流失，影响ALP、OCN和TNF-α等水平[12]。在脂多糖(LPS)诱导C57BL/6小鼠骨质疏松模型中，每天分别经腹腔注射10 、30 mg/kg梓醇，持续7 d，均可以减少骨丢失，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色显示梓醇显著抑制过度的破骨细胞形成[13]；在卵巢切除8周雌性C57BL/6中，每天分别经腹腔注射10 、30 mg/kg梓醇，持续6周，可缓解破骨细胞过度形成，高剂量梓醇显著降低血清CTX-1水平[13]。在卵巢切除8周雌性BALB/c小鼠和14个月雌性自然衰老BALB/c小鼠中，脾细胞中Th1/Th2比值均明显增大，与骨密度呈负相关；在前者模型中，灌胃梓醇可以显著增加骨密度，并且呈剂量依赖性[14]。而且，梓醇并未升高血清雌激素水平，而显著降低血清CTX-I水平，并且呈剂量依赖性，说明可能与抑制破骨细胞功能有关[14]。此外，灌胃梓醇后小鼠脾细胞中Th1细胞比例下降，而Th2细胞比例上升，而且，梓醇调节Th1/Th2比例也呈剂量依赖性。进一步地，梓醇对调节Th1/Th2亚群比例的关键转录因子的调节作用也呈剂量依赖性[14]，这可能是梓醇发挥骨保护作用的分子机制之一。

笔者通过上述文献研究发现，在体内研究方面，大鼠[8-10,12]、小鼠[11,13-14]、雄性[8,10-13]、雌性[8-10,13-14]等动物研究对象和颅骨缺损[8-9]、卵巢切除[8-9,13-14]、高脂饲料联合STZ[10-11]、尼古丁诱导[12]、LPS诱导[13]等造模方法的实验结果均显示梓醇具有抗骨质疏松作用。梓醇对于卵巢切除和糖尿病等常见骨质疏松模型均发挥防治作用，说明其可用于治疗高转换型和低转换型等不同类型的骨质疏松症，这可能与其多靶点的作用机制有关，体内作用机制仍待进一步深入研究。

2 梓醇抗骨质疏松作用的体外实验研究

2.1 梓醇对于BMSCs的影响

在SD大鼠BMSCs中，梓醇25、50、100 μmol/L 作用24 h或者10、25、50、100 μmol/L 作用48 h均显著促进增殖；此外，梓醇50 μmol/L或100 μmol/L增强了ALP活性，而且茜素红染色也验证了促成骨活性[9]，该作用可能与激活JAK2/STAT3轴有关[9]。在SD大鼠BMSCs中，梓醇促进细胞增殖和成骨分化，最佳浓度分别为1.0 mg/L和2.0 mg/L，梓醇促进向成骨细胞分化和转化后的成骨细胞成熟，上调Runx2 和OCN表达，增加ALP 的分泌沉积。该作用可能与Wnt信号通路激活有关[15]；类似地，10、50 、250 μmol/L梓醇并不影响增殖，而三个浓度均增加ALP活性且三者间无显著性差异，50 μmol/L和250 μmol/L的梓醇可以显著增强茜素红染色[8]。进一步，梓醇增加成骨分化相关基因和蛋白的表达，且被初步证实与激活Wnt/β-catenin信号通路有关[8]。在SD大鼠BMSCs中，梓醇0.05 mg/L～10 mg/L均促进增殖，其中浓度1.0 mg/L作用最强；当浓度大于等于20 mg/L时，梓醇对增殖能力无明显影响。梓醇0.2～100 mg/L均可以增强ALP 活性，其中浓度2.0 mg/L组ALP活性显著高于其它组。梓醇0.2、1.0、2.0、20 mg/L均可以增加矿化结节数量，促进成骨细胞成熟[16]。在SD大鼠BMSCs中，不同浓度的梓醇促进了增殖；1×10-5mol/L～ 1×10-3mol/L梓醇可以诱导成骨分化，1×10-4mol/L为最佳浓度；梓醇还可以增加ALP活性、矿化结节数目和OCN含量；该作用机制可能与Hedgehog信号通路有关[17]。

2.2 梓醇对于成骨细胞的影响

在MC3T3-E1中，梓醇1×10-9mol/L～1×10-7mol/L促进增殖；梓醇1×10-6mol/L ～1×10-5mol/L增强ALP和OCN活性，促进钙化[18]；在SD大鼠成骨细胞中，梓醇1×10-3、1×10-5、1×10-7、1×10-9mol/L均促进增殖。ALP活性显示高浓度梓醇显著促进成骨分化，具有量效关系。不同浓度梓醇均显著增强OCN活性[19]。

在MC3T3-E1中，梓醇在很高浓度条件下，细胞活力未被抑制。不同时间点不同浓度的梓醇均未明显促进增殖。梓醇浓度达到500 mg/L时，明显升高ALP 活性，且促进钙结节形成[20]。在以成骨细胞为色谱膜源筛选六味地黄汤中抗骨质疏松活性成分的实验中，对于亲和强度以及含量较高的梓醇进行了体内外药效验证，验证了梓醇(1.0、10 μmol/L)显著促进小鼠成骨细胞增殖，且提高骨质疏松斑马鱼模型的头部骨矿化面积[21]。类似地，通过成骨细胞膜色谱/质谱法快速筛选了六味地黄煎剂含药血清中的成骨活性成分，梓醇等四者(浓度均为0.1 μmol/L)均能显著促进MC3T3-E1增殖和ALP染色[22]。

2.3 梓醇对于高糖造模成骨细胞的影响

在高糖造模MC3T3-E1中，梓醇能够通过调节BMP和IGF-1/PI3K/mTOR途径促进增殖和增强ALP活性，并通过信号通路抑制剂和分子对接研究加以证实[10]。在高糖造模MC3T3-E1中，1、10 μmol/L的梓醇均能够增加ALP表达，二者的钙化基质茜素红染色斑均更密集、更广泛，而且显著增加OPG/RANKL的比值[11]。在高糖造模MC3T3-E1中，1、2、4 mg/mL的梓醇可以剂量依赖地改善受损增殖状态，且ALP活性和矿化结节数量增加，成骨分化相关蛋白表达增加。进一步实验发现，梓醇通过抑制高糖诱导的KDM7A蛋白表达而调节Wnt/β-catenin信号通路[23]。

2.4 梓醇对于其他成骨细胞模型的影响

在LPS造模SD大鼠成骨细胞中，梓醇浓度小于1 mg/L时，未明显促进增殖；当浓度大于10 mg/L时，则明显促进增殖并无毒性作用；当浓度小于1 mg/L时，未明显保护成骨细胞炎性反应；而浓度大于10 mg/L时，则明显保护细胞炎性反应[24]。在2,3,7,8-四氯二苯对二噁英造模MC3T3-E1中，梓醇抑制细胞活性减弱，抑制增加的细胞凋亡和自噬，降低一氧化氮和硝酸盐水平，抑制细胞色素P450 1A1和细胞外信号调节激酶水平升高。而且，梓醇能够修复超氧化物歧化酶和细胞外信号调节激酶1基因表达，显著增加谷胱甘肽过氧化物酶4和成骨分化标志物(包括ALP和osterix)表达[25]。在SD大鼠成骨细胞-破骨细胞共育体系中，梓醇(0.05 mg/L～2 mg/L)显著促进成骨细胞增殖，其中，0.05 mg/L作用效果最强，0.05 mg/L还显著升高ALP水平。而且，尽管该浓度下梓醇对于成骨细胞中ERα的mRNA表达无影响，但是其显著上调成骨细胞中ERβ的mRNA表达[26]。

2.5 梓醇对于破骨细胞的影响

在小鼠骨髓巨噬细胞和RAW264.7经RANKL诱导分化的破骨细胞中，梓醇(0、100、200、400 μmol/L)呈现浓度依赖性的早期抑制破骨分化，破骨细胞数量和面积均减少，但并未促进细胞凋亡[9]。F-肌动蛋白环和骨吸收陷窝实验显示梓醇减小成熟破骨细胞F-肌动蛋白环尺寸和骨片骨吸收陷窝面积。梓醇还抑制破骨相关基因表达，梓醇通过调节NF-κB 和AKT信号途径抑制NFATc1基因表达。PTEN被认为是RANKL诱导破骨细胞生成的重要调控因子，PTEN在破骨细胞形成过程中调控RANKL刺激的AKT和NF-κB信号通路，梓醇可以通过调节PTEN的泛素化和降解以抑制破骨分化[13]。在上述共育体系中，0.05 mg/L浓度的梓醇作用48、72、96 h 后显著抑制破骨细胞的骨吸收陷窝数量和TRAP活性[26]；梓醇0.05 mg/L～50 mg/L显著减少骨吸收陷窝数目，可以抑制破骨细胞活性，0.05 mg/L梓醇诱导破骨细胞凋亡，其机制可能与上调成骨细胞中OPG基因表达有关[27]。

通过上述文献研究发现，在促进细胞增殖方面，多个体外实验结果显示梓醇具有一定的促进BMSCs[11,13]和成骨细胞[8,14-15,17-18,20]增殖作用；在促进细胞成骨分化方面，多个体外实验结果显示梓醇具有一定的促进BMSCs[7,11-13]和成骨细胞[8,14-20]成骨分化作用，可能影响Wnt和Hedgehog等信号通路。此外，梓醇还具有一定的抑制破骨活性作用[9,20-21]，可能影响PTEN/RANKL信号通路。

3 讨论和总结

结合上述体内外研究结果，笔者认为梓醇具有一定的抗骨质疏松活性，这与其能够促进BMSCs及成骨细胞增殖和分化、抑制破骨细胞活性有关，很可能从几个方面同时发挥作用，体现了其多靶点作用的治疗特点，可能对于成骨不足的低转换型和破骨明显大于成骨的高转换型骨质疏松均具有防治作用，而且可以促进大鼠骨折愈合[28]。将体内动物实验和体外细胞模型相结合进行研究对于阐明梓醇的抗骨质疏松作用意义重大。

中药地黄具有滋阴养血、益精填髓等功效，具有一定的降糖作用[3]，同时具有抗骨质疏松作用[2-4]，其组方在临床上也多用于糖尿病性骨质疏松症的治疗[5]。而梓醇作为地黄的主要药效成分，也具有降糖和改善糖尿病并发症[7]以及抗糖尿病性骨质疏松(糖尿病并发症之一)的作用[10,23,29]，梓醇是否通过影响糖尿病和骨代谢关键分子AMPK[30]而发挥作用？这些问题以及相关作用机制仍待解决和深入研究。

目前，已有越来越多的文献报道了有关骨质疏松症治疗药物的新发现[31]，对于梓醇抗骨质疏松作用靶点方面仍待深入挖掘。结合梓醇化合物具有的自身抗氧化性质[7]，正如已有文献报道[13,25]，建议多从氧化还原反应角度加以深入探究。综上所述，梓醇抗骨质疏松作用的深入研究将有助于解析中药地黄防治骨质疏松症的作用机制以及开发疗效更佳的抗骨质疏松治疗药物。