梓醇对IL-1β诱导软骨细胞损伤的保护机制研究

马玲，钟利国，崔裕如，刘彬

骨关节炎（osteoarthritis，OA）属于慢性退行性关节疾病，是导致残疾的主要原因，而炎性细胞因子与OA 发病关系密切［1-2］。白细胞介素（IL）-1β 可诱导软骨细胞释放蛋白水解酶和其他炎性细胞因子产生，促进OA 发生［3］。梓醇是一种中药提取物，具有减轻IL-1β 诱导的大鼠软骨细胞炎症反应、细胞凋亡以及细胞外基质降解的作用，是治疗OA的潜在药物［4-5］，但其作用机制尚不明确。miR-140-5p 为调节软骨稳态的特异性miRNA，其表达失调与OA 严重程度有关［6］。研究显示，miR-140-5p 水平在OA和IL-1β 诱导的软骨细胞损伤中表达下调，其过表达可抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症反应和细胞凋亡［7］。新近研究发现，梓醇可通过上调miR-140-5p表达抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡［8］。本研究旨在探讨梓醇对OA 的改善作用与miR-140-5p 的关系。

1 材料与方法

1.1 主要材料

选取2019 年7 月—2020 年7 月于荆州市第一人民医院接受治疗的20例膝关节炎患者为研究对象，所有患者均行膝关节置换术，术中切除软骨组织。其中男12例，女8例，年龄43～56岁，平均（48.63±3.26）岁。梓醇购自成都瑞芬思生物科技有限公司（纯度90%）；IL-1β 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自美国Sigma公司；IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ 干扰素（IFN-γ）ELISA 试剂盒购自英国Abcam 公司；RNA提取试剂盒、miRNA 提取试剂盒、SYBR Green 试剂盒、反转录试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；DMEM 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、凋亡试剂盒购自碧云天生物；Lipofectamine2000 购自美国Invitrogen；miR-NC、miR-140-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-140-5p 购自广州锐博生物科技有限公司；兔抗人活化的胱天蛋白酶3（Cleavedcaspase 3）、活化的胱天蛋白酶9（Cleaved-caspase 9）抗体购自武汉艾美捷公司；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体与辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG 二抗购自美国Santa Cruz 公司。MIR-162-PC/MIR-262-PC 型培养箱购自日本松下公司；BD FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪购自美国BD 公司；ABI StepOnePlus 荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems 公司；MODEL550型酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1 人膝关节软骨细胞分离和培养

取出软骨组织标本后剪碎，加入胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶后置于培养箱内消化细胞，接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基，取第3代细胞进行后续实验［9］。

1.2.2 CCK-8法检测梓醇的细胞毒性

将软骨细胞以2 000个/孔接种于96孔板中。在37 ℃和5%CO2条件下孵育24 h后，用不同浓度的梓醇（0、0.1、1、10、20、50和100 ng/L）处理细胞24 h。每孔加入10 µL的CCK-8溶液。在37 ℃下孵育2 h，使用酶标仪测量各孔在450 nm波长处的吸光度（A450），计算细胞活力（%）=（经药物处理的细胞A450/对照细胞A450）×100%。

1.2.3 分组及处理

软骨细胞接种于6 孔板，加入含有10 µg/L IL-1β 的DMEM培养基培养48 h［10］，记为IL-1β组，不含IL-1β的正常完全培养基培养的软骨细胞为对照（Con）组。分别加入含有不同浓度（10、20及50 ng/L）的梓醇［4］与IL-1β（10µg/L）培养24 h，分别记为IL-1β+梓醇-低组、IL-1β+梓醇-中组、IL-1β+梓醇-高组。采用脂质体转染法将miR-NC、miR-140-5p mimics分别转染至软骨细胞，转染成功后加入IL-1β（10µg/L）培养24 h，分别记为IL-1β+miR-NC 组、IL-1β+miR-140-5p组。采用脂质体转染法将anti-miR-NC、anti-miR-140-5p分别转染至软骨细胞，转染成功后加入梓醇（50 ng/L）、IL-1β（10µg/L）培养24 h，分别记为IL-1β+梓醇+anti-miR-NC 组、IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p组。

1.2.4 CCK-8法检测细胞活力

将各组软骨细胞接种到96孔板（2 000个/孔）中，按1.2.3进行分组与处理。培养24 h 后，每孔加入10 µL CCK-8 溶液。酶标仪检测每个孔中的A450值。

1.2.5 ELISA检测IL-6、TNF-α、IFN-γ水平

收集各组软骨细胞培养液，4 ℃下12 000×g离心10 min后吸取上清液，参照试剂盒说明书，检测各组IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡

各组软骨细胞胰蛋白酶消化后，重悬于500µL结合缓冲液中。随后，加入5µL Annexin-V-FITC 和5µL PI 染色液，混合后避光孵育30 min。使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.7 实时荧光定量（qPCR）检测miR-140-5p表达水平

用RNA 提取试剂盒提取各组软骨细胞总RNA，反转录合成cDNA，在荧光定量PCR仪上进行扩增。miR-140-5p引物：上游5'-CGCATGGCAGTGGTTTTACCCTA-3'，下游5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；U6引物：上游5'-CTCGCT TCGGCAGCACATATACT-3'，下游5'-ACGCTTCACGAATTT GCGTGTC-3'。反应体系（20µL）：SYBR mix 9.0µL、上下游引物各0.5µL、cDNA 模板2.0µL、RNase dH2O 8.0µL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，共40个循环；72 ℃延伸1 min。以U6为内参，2-ΔΔCt法计算miR-140-5p的相对表达量。

1.2.8 Western blot 法检测Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白相对表达水平

提取各组软骨细胞总蛋白，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质（30µg）并转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜封闭2 h，与一抗Cleaved-caspase 3（1∶1 000）、Cleavedcaspase 9（1∶1 000）、GAPDH 抗体（1∶2 000）在4 ℃孵育24 h，加二抗（1∶3 000）室温孵育1 h，用增强的化学发光试剂显影，Image J软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 梓醇对软骨细胞的细胞毒性作用

0、0.1、1、10、20、50 和100 ng/L 梓醇处理后，软骨细胞活性（%）分别为100.12±13.46、99.47±12.58、 98.56±13.11、 96.70±12.65、 95.82±12.39、96.35±12.42、93.47±12.51，差异无统计学意义（n=9，F=0.299，P＞0.05），梓醇浓度在0～100 ng/L 之间对软骨细胞没有细胞毒性作用。

2.2 梓醇对IL-1β诱导软骨细胞的影响

2.2.1 细胞活力和炎症反应

与Con组比较，IL-1β组细胞活力降低，而IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平升高（P＜0.05）；与IL-1β 组比较，IL-1β+梓醇-低组、IL-1β+梓醇-中组、IL-1β+梓醇-高组细胞活力升高，而IL-6、TNF-α、IFN-γ水平依次降低（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of chondrocyte viability and expression levels of inflammatory cytokines between the five groups表1 各组软骨细胞活力和炎性因子表达水平比较（n=9，±s）

Tab.1 Comparison of chondrocyte viability and expression levels of inflammatory cytokines between the five groups表1 各组软骨细胞活力和炎性因子表达水平比较（n=9，±s）

＊＊P＜0.01；a与Con组比较，b与IL-1β组比较，c与IL-1β+梓醇-低组比较，d与IL-1β+梓醇-中组比较，P＜0.05。

组别Con组IL-1β组IL-1β+梓醇-低组IL-1β+梓醇-中组IL-1β+梓醇-高组F细胞活力/A450 0.78±0.08 0.31±0.04a 0.42±0.05ab 0.52±0.06abc 0.64±0.07abcd 80.005＊＊IL-6/（ng/L）9.97±0.93 86.55±7.18a 64.19±5.47ab 43.40±4.87abc 16.67±1.39abcd 429.566＊＊组别Con组IL-1β组IL-1β+梓醇-低组IL-1β+梓醇-中组IL-1β+梓醇-高组F TNF-α/（ng/L）5.78±0.56 74.05±7.01a 55.88±4.56ab 30.88±3.44abc 9.89±0.85bcd 471.325＊＊IFN-γ/（ng/L）31.71±3.11 163.14±11.33a 115.22±10.34ab 79.56±7.38abc 44.61±4.17abcd 408.467＊＊

2.2.2 细胞凋亡和miR-140-5p表达

与Con组比较，IL-1β组细胞凋亡率和Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9 蛋白表达水平升高，miR-140-5p表达水平降低（P＜0.05）；与IL-1β组比较，IL-1β+梓醇-低组、IL-1β+梓醇-中组、IL-1β+梓醇-高组细胞凋亡率和Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白表达水平依次降低，miR-140-5p表达水平依次升高（P＜0.05），见图1、2，表2。

Fig.1 Apoptosis of chondrocytes in each group图1 各组软骨细胞凋亡水平

Fig.2 Expression levels of apoptosis-related proteins in each group图2 各组软骨细胞凋亡相关蛋白表达

Tab.2 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the five groups表2 各组软骨细胞凋亡率、Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白表达和miR-140-5p表达水平比较（n=9，±s）

Tab.2 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the five groups表2 各组软骨细胞凋亡率、Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白表达和miR-140-5p表达水平比较（n=9，±s）

＊＊P＜0.01；a与Con组比较，b与IL-1β组比较，c与IL-1β+梓醇-低组比较，d与IL-1β+梓醇-中组比较，P＜0.05。

组别Con组IL-1β组IL-1β+梓醇-低组IL-1β+梓醇-中组IL-1β+梓醇-高组F凋亡率/%6.31±0.52 32.63±3.16a 22.90±2.13ab 15.71±1.41abc 9.04±0.73abcd 297.530＊＊Cleaved-caspase 3 0.13±0.02 0.58±0.04a 0.45±0.04ab 0.31±0.03abc 0.19±0.02abcd 314.265＊＊组别Con组IL-1β组IL-1β+梓醇-低组IL-1β+梓醇-中组IL-1β+梓醇-高组F Cleaved-caspase 9 0.28±0.03 0.77±0.06a 0.64±0.05ab 0.51±0.04abc 0.35±0.03abcd 193.026＊＊miR-140-5p 1.00±0.00 0.26±0.03a 0.46±0.03ab 0.69±0.06abc 0.96±0.07bcd 442.922＊＊

2.3 miR-140-5p 过表达对IL-1β 诱导后软骨细胞的影响

2.3.1 细胞活力和炎症反应

与IL-1β+miR-NC 组比较，IL-1β+miR-140-5p组细胞活力升高，而IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平降低（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of cell viability and inflammatory cytokines in chondrocytes between the two groups表3 各组软骨细胞活力A值和炎性因子表达水平比较（n=9，±s）

Tab.3 Comparison of cell viability and inflammatory cytokines in chondrocytes between the two groups表3 各组软骨细胞活力A值和炎性因子表达水平比较（n=9，±s）

＊＊P＜0.01。

组别IL-1β+miR-NC组IL-1β+miR-140-5p组t细胞活力/A450 0.33±0.04 0.56±0.06 9.569＊＊IL-6/（ng/L）87.72±7.93 23.21±2.18 23.532＊＊组别IL-1β+miR-NC组IL-1β+miR-140-5p组t TNF-α/（ng/L）77.31±6.24 13.61±1.19 30.083＊＊IFN-γ/（ng/L）165.82±14.54 55.09±4.99 21.830＊＊

2.3.2 细胞凋亡和Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白水平以及miR-140-5p表达

与IL-1β+miR-NC 组比较，IL-1β+miR-140-5p组细胞凋亡率、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白水平降低，miR-140-5p 表达水平升高（P＜0.01），见图3、表4。

Fig.3 Apoptosis levels of chondrocytes in each group图3 过表达miR-140-5p后各组软骨细胞凋亡水平

Tab.4 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the two groups表4 miR-140-5p过表达后各组软骨细胞凋亡率，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达和miR-140-5p表达水平比较（n=9，±s）

Tab.4 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the two groups表4 miR-140-5p过表达后各组软骨细胞凋亡率，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达和miR-140-5p表达水平比较（n=9，±s）

＊＊P＜0.01。

组别IL-1β+miR-NC组IL-1β+miR-140-5p组t凋亡率/%31.73±2.96 12.12±1.16 18.505＊＊Cleaved-caspase 3 0.59±0.05 0.25±0.02 18.941＊＊组别IL-1β+miR-NC组IL-1β+miR-140-5p组t Cleaved-caspase 9 0.79±0.06 0.40±0.04 16.225＊＊miR-140-5p 1.00±0.12 2.88±0.24 21.019＊＊

2.4 下调miR-140-5p 表达逆转了梓醇对IL-1β 诱导软骨细胞损伤

2.4.1 细胞活力和炎症反应

与IL-1β+梓醇+anti-miR-NC组比较，IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p 组细胞活力降低，而IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高（P＜0.01），见表5。

Tab.5 Comparison of cell viability and inflammatory cytokines in chondrocytes between the two groups表5 下调miR-140-5p后各组软骨细胞活力和炎性因子表达水平比较（n=9，±s）

＊＊P＜0.01。

组别IL-1β+梓醇+anti-miR-NC组IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p组t细胞活力/A450 0.65±0.06 0.39±0.04 10.817＊＊IL-6/（ng/L）15.96±1.29 73.17±6.54 25.747＊＊组别IL-1β+梓醇+anti-miR-NC组IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p组t TNF-α/（ng/L）9.07±0.75 61.39±5.07 30.625＊＊IFN-γ/（ng/L）42.37±4.29 123.94±10.94 20.824＊＊

2.4.2 细胞凋亡、Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9蛋白水平以及miR-140-5p表达

与IL-1β+梓醇+anti-miR-NC组比较，IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p 组细胞凋亡率，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9 蛋白水平升高，miR-140-5p表达水平降低（P＜0.01），见图4、表6。

Fig.4 Apoptosis levels of chondrocytes in each group图4 下调miR-140-5p后各组软骨细胞凋亡水平

Tab.6 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the two groups表6 下调miR-140-5p后各组软骨细胞凋亡率，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达和miR-140-5p表达水平比较（n=9，±s）

Tab.6 Comparison of apoptosis rate,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9 protein expression and miR-140-5p expression levels between the two groups表6 下调miR-140-5p后各组软骨细胞凋亡率，Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达和miR-140-5p表达水平比较（n=9，±s）

＊＊P＜0.01。

组别IL-1β+梓醇+anti-miR-NC组IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p组t凋亡率/%9.16±0.65 25.21±2.19 21.078＊＊Cleaved-caspase 3 0.17±0.02 0.49±0.05 17.827＊＊组别IL-1β+梓醇+anti-miR-NC组IL-1β+梓醇+anti-miR-140-5p组t Cleaved-caspase 9 0.33±0.03 0.66±0.04 19.800＊＊miR-140-5p 1.00±0.00 0.32±0.04 51.000＊＊

3 讨论

OA 的主要治疗药物是非甾体抗炎药，可缓解OA症状［11］。然而，长期使用非甾体抗炎药可能导致胃肠道和心血管疾病［12］。因此，寻找新的潜在治疗药物对改善OA 有重要意义。软骨细胞的过度凋亡和细胞炎症反应是OA 的主要病理特征。基于OA的发病机制，已有研究表明部分中药及其活性成分（如白藜芦醇、灯盏花乙素）可用于治疗OA，减轻软骨细胞损伤［13］。梓醇是一种从地黄根中分离出来的环烯醚萜苷，有抗炎作用［4-5，14］。IL-1β 可触发炎性细胞因子的释放以及软骨细胞凋亡，被广泛应用于OA 的病理生理学研究［5，10］。本研究结果显示，IL-1β 诱导的软骨细胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平升高，软骨细胞凋亡率和Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9 蛋白水平均升高，表明IL-1β 可诱导软骨细胞凋亡。曾允富等［4］研究显示，梓醇可抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡。本研究亦显示，梓醇可降低促炎细胞因子水平和细胞凋亡率以及Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9 蛋白表达，提示梓醇可抑制IL-1β 诱导的软骨细胞炎性损伤和细胞凋亡，再次证实了梓醇可能是改善OA的潜在药物。

miRNA 在骨关节炎中表达异常，并可参与OA发生、发展［15-16］。miR-140-5p 是一种在OA 中特异性表达的新型非编码miRNA。研究显示，miR-140-5p 在人OA 软骨中表达降低［17］。过表达miR-140-5p对IL-1β诱导的软骨细胞炎症和细胞凋亡具有抑制作用［7］。本研究显示，在IL-1β 诱导的软骨细胞中，miR-140-5p 表达量较正常培养的软骨细胞降低，过表达miR-140-5p 后，IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡和炎性损伤均减轻，表明miR-140-5p 在OA 中可能发挥保护作用。梓醇可增加IL-1β诱导的软骨细胞中miR-140-5p 的表达量，表明梓醇可促进miR-140-5p 表达。此外，下调miR-140-5p 表达可拮抗梓醇对IL-1β诱导的软骨细胞炎症及细胞凋亡的抑制作用，提示梓醇可能通过上调miR-140-5p减缓IL-1β诱导的软骨细胞炎症反应及凋亡。

综上所述，梓醇可通过上调miR-140-5p表达来减轻IL-1β诱导的软骨细胞炎性因子的释放以及凋亡，且miR-140-5p 可能是梓醇改善OA 的潜在靶点。在未来的研究中将对miR-140-5p 的下游靶标进行分析，并结合体内实验进一步验证梓醇对OA发挥保护作用的分子机制。