不同方法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的比较研究

卢心鹏, 刘 蓉, 黄文博, 赵 瑾, 李洪涛

(广州医科大学附属第一医院,呼吸疾病国家重点实验室,广州呼吸健康研究院,广州 510120)

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）简称慢阻肺，是一种气流受限不完全可逆、呈进行性发展的疾病，以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为主要特征。随着发达国家人口老龄化进展、发展中国家吸烟人数上升和生物燃料污染严重，世界卫生组织预计未来COPD 的发病率将持续升高，到2060 年可能将有超过540 万人/年死于COPD 及相关疾病［1］。我国COPD 的发病状况也相当严重，40 岁以上人群COPD的死亡率达到13.7%［2］。作为一种高致残率和高病死率的疾病，COPD的防治始终是临床和基础研究的重点之一。建立与临床患者疾病发生发展及病理变化相符合的动物模型，是研究COPD 发病机制与治疗药物的基础。目前建立COPD 动物模型的常见方法有两种，即烟草烟雾暴露（cigarette smoke exposure，CSE）以及CSE 联合细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）暴露（CSE+LPS）［3-5］，但尚未有关于这两种方法建立大鼠COPD模型的对比研究报告。本研究对CSE和CSE联合气道内滴注LPS两种方法建立的大鼠COPD模型进行评价和对比分析。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只SPF级雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量140～160 g，购于浙江维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（浙）2019-0001］。大鼠饲养于广州医科大学实验动物中心屏障环境［SYXK（粤）2020-0227］，温度22～25 ℃，湿度恒定，12 h 日夜交替照明。本实验所涉及的动物实验操作均经过广州医科大学附属第一医院实验动物伦理委员会批准（No.202040A）。

1.2 主要仪器和试剂

小动物有创肺功能仪（BUXCO，美国），自制小动物密封熏烟箱（规格为100 cm×60 cm×60 cm），全波长多功能酶标仪（Thermo，美国）。红玫牌香烟（广东中烟工业有限责任公司，焦油量12 mg，烟碱量1.1 mg，一氧化碳量15 mg），细菌脂多糖（Sigma，美国），使用时用生理盐水（即0.9%NaCl 溶液）配制成1 mg/mL溶 液。大 鼠IL-8 和TNF-ɑ 检 测 用ELISA 试 剂 盒（R&D，美国）。

1.3 大鼠COPD模型制备

将SD 大鼠随机分为对照组、CSE 组和CSE+LPS组，每组10 只。分别采用CSE 法和CSE 联合LPS 气管滴注法制备大鼠COPD模型［6-7］。方法如下：CSE组大鼠置于熏烟箱，点燃10支香烟进行烟雾暴露1 h，每天上午和下午各1次，中间间隔6 h；每周熏烟6 d，共24周。CSE+LPS 组大鼠熏烟方式与CSE 组相同，并于第9、10、12周的第一天，将大鼠用2%异氟烷麻醉，固定于自制固定板上，在喉镜下经大鼠气道滴注LPS，每只大鼠每次给药0.2 mg/kg；给予LPS 当天不熏烟［7-8］。对照组大鼠在正常环境下饲养。

1.4 大鼠肺功能指标测定

造模结束后，大鼠按体质量给予3%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定行气管插管，连接小动物有创肺功能仪，测定大鼠有创肺功能指标，包括：气道阻力（airway resistance，RI）、潮气量（tidal volume，TV）、静态肺顺应性（chord compliance，Cchord）、功能残气量（functional residual capacity，FRC）、每分钟通气量（minute volume，MV）、第50 ms 用力呼气容积（forced expiratory volume in 50 ms，FEV50）和用力呼气容积比（forced vital capacity，FVC）等参数，计算FEV50/FVC。

1.5 肺组织病理学观察

肺功能测定完成后，打开大鼠胸腔，暴露心脏取血，然后取左肺叶组织，用质量分数为4%的多聚甲醛溶液固定24 h 后，常规依次脱水、石蜡包埋、切成4 μm 的薄片，并用苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜（100倍视野）下观察肺组织病理学变化。

1.6 大鼠血清IL-8和TNF-ɑ测定

各组大鼠心脏取血，室温静置1 h，3 000 r/min 离心10 min，分离血清。采用ELSIA法以酶标仪检测IL-8、TNF-ɑ水平。具体步骤按照试剂盒说明书操作。

1.7 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件进行实验结果数据分析。计量材料采用±s表示。多组间样本比较先进行单因素方差分析，有统计学意义时，组内两组间两样本再采用LSD-t检验进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

对照组大鼠精神良好，饮食正常，毛发有光泽，呼吸平稳，无气促。CSE 组和CSE+LPS 组大鼠在造模期间均出现精神萎靡、咳嗽、气促、毛发枯黄等症状，而且进食饮水量减少。造模结束后，CSE组和CSE+LPS组大鼠平均体质量分别为（524±21）g和（513±14）g，与对照组［（666±19）g］相比有明显差异（P＜0.05），而CSE组和CSE+LPS组之间无明显差异，见图1。

图1 造模后各组大鼠的体质量生长曲线图Figure 1 Body weight growth curve of rats in each group after modeling

2.2 各组大鼠肺功能参数比较

大鼠肺功能测定结果显示，CSE 组和CSE+LPS 组大鼠的RI、Cchord、FRC 值均明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），TV、MV、FEV50/FVC均明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；和CSE 组 比 较，CSE+ LPS 组 的RI、FRC 值 显 著 升 高，FEV50/ FVC 显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 造模后各组大鼠的肺功能指标Table 1 Lung functions of rats in each group after modeling（±s,n=10）

表1 造模后各组大鼠的肺功能指标Table 1 Lung functions of rats in each group after modeling（±s,n=10）

注：Control 指正常环境下饲养的对照组，CSE 指烟草烟雾暴露组，CSE+LPS 指烟草烟雾暴露联合细菌脂多糖气道内滴注组。RI 即气道阻力，TV即潮气量，Cchord即静态肺顺应性，FRC即功能残气量，MV即每分钟通气量，FEV50/FVC即第50 ms用力呼气容积和用肺活量之比。★表示与Control组比较，P ＜0.05；#表示与CSE组比较，P ＜0.05。Note：Control，rats in the control group raised in a normal environment；CSE，rats in the cigarette smoke exposure group；CSE+LPS，rats in the intratracheal LPS instillation combined with CSE group. There were 10 rats in each group. RI，airway resistance；TV，tidal volume；Cchord，chord compliance；FRC，functional residual capacity；MV，minute volume；FEV50/FVC，forced expiratory volume in 50 ms VS forced vital capacity. ★Represent significant differences compared to the control group，P ＜0.05；#Represent significant differences compard to the CSE group，P ＜0.05.

Group Control CSE CSE+LPS RI/(cmH2O·s-1·mL-1)0.250±0.026 0.315±0.018★0.348±0.025★#TV/mL 3.90±0.19 3.64±0.10★3.57±0.14★Cchord/(mL·cmH2O-1)1.210±0.042 1.310±0.071★1.395±0.120★FRC/mL 5.29±0.51 5.88±0.59★6.58±0.44★#MV/mL 233.98±11.40 218.72±5.18 214.12±8.60★FEV50/(FVC/%)0.155±0.041 0.118±0.030★0.099±0.035★#

2.3 各组大鼠肺组织病理学形态

HE 染色后光学显微镜下观察大鼠肺组织切片肺泡及小气道周围炎症情况，结果发现：对照组大鼠肺组织肺泡结构完整连续，未见明显炎性细胞浸润，肺泡间隔整齐无断裂；CSE 组大鼠小气道支气管壁增厚，气道周围炎性细胞浸润，肺泡间隔增宽且炎性细胞浸润，邻近肺组织、肺泡腔呈代偿性扩张；CSE+LPS 组大鼠肺组织与CSE 组大鼠类似，除了支气管壁增厚、肺组织间隙存在炎性细胞浸润、肺泡间隔扩大外，还可见部分肺泡间隔变薄、断裂，形成肺大泡（图2）。

图2 各组大鼠肺组织病理形态变化（HE染色，×100）Figure 2 Pathological changes of lung tissues of rats in each group（HE staining，×100）

2.4 各组大鼠血清IL-8和TNF-ɑ含量

与对照组比较，CSE 组和CSE+LPS 组大鼠血清中IL-8 含量均明显升高（P＜0.05），CSE 组和CSE+LPS组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，CSE组和CSE+LPS组的TNF-ɑ含量也均明显升高（P＜0.05），而且CSE+LPS 组TNF-ɑ 含量明显高于CSE 组（P＜0.05）。各组数据详见表2。

表2 各组大鼠血清中IL-8和TNF-ɑ含量Table 2 Serum contents of IL-8 and TNF-ɑ in different groups of rats（±s,n=10）

表2 各组大鼠血清中IL-8和TNF-ɑ含量Table 2 Serum contents of IL-8 and TNF-ɑ in different groups of rats（±s,n=10）

注：Control 指正常环境下饲养的对照组，CSE 指烟草烟雾暴露组，CSE+LPS 指烟草烟雾暴露联合细菌脂多糖气道内滴注组。与Control组比较，★P ＜0.05；与CSE组比，#P ＜0.05。Note：Control，rats in the control group raised in a normal environment；CSE，rats in the cigarette smoke exposure group；CSE+LPS，rats in the intratracheal LPS instillation combined with CSE group. There were 10 rats in each group. ★Represent significant differences compared to the control group，P ＜0.05；#Represent significant differences compared to the CSE group，P ＜0.05.

Group Control CSE CSE+LPS IL-8 ρ/(pg·mL-1)77.48±11.65 162.87±17.95★160.72±33.04★TNF-ɑ ρ/(pg·mL-1)57.43±9.30 109.35±13.78★141.10±18.82★#

3 讨论

COPD是一种常见的呼吸系统疾病，其特征是持续气流受限同时伴有支气管慢性炎症增加。目前COPD发生发展的确切原因并不明确。吸烟是COPD 高度相关的危险因素，烟草中含有多种有害化学成分和细小颗粒，能引起肺部炎性反应、气道阻塞和肺泡结构改变［2］。建立符合临床实际的COPD 动物模型，是研究COPD发病机制的重要基础，也是深入研究COPD的重要部分。理想的COPD 动物模型应具有与人类疾病相一致的临床特征，满足以气流受限为特征的肺功能改变、气道损伤和肺内炎症细胞增多等条件［9］。大鼠、小鼠、豚鼠、猪、马、兔、比格犬等动物均可用于建立COPD 模型。其中，大鼠因基因组序列与人类基因组类似，容易进行基因调控，而且繁殖周期短、饲养成本低等特点，成为最常用的COPD 模型动物。与小鼠模型相比，大鼠的取材也更加方便。

目前常见的COPD 动物造模方法有多种，如CSE［6，10］、可吸入颗粒物质暴露［11-12］、气管注射LPS［13］等。本研究选择了CSE 和CSE 联合气管滴注LPS所诱导的COPD大鼠模型，并对这两种方法建立的模型进行比较评价。

肺功能检测和肺组织病理检查是目前公认的评价COPD 动物模型建立是否成功的标准。本研究结果显示，单纯CSE 方法和CSE 联合气管滴注LPS 方法建立的COPD 模型大鼠的肺功能均比对照组明显下降，肺部炎性细胞明显增多，出现肺泡结构紊乱和气道黏液高分泌等慢阻肺症状，这与用CSE 联合LPS 气管滴注法建立小鼠COPD 模型和用单纯CSE 法建立老年（22周龄）大鼠COPD 模型显示的肺功能和肺组织病理学变化［7-8，14］是一致的，表明本研究中两种方法建立的COPD大鼠模型均成功。

LPS 是革兰阴性细菌细胞壁的主要促炎性糖脂，进入肺脏后能刺激单核细胞、内皮细胞及中性粒细胞，合成释放一系列炎症介质，导致肺部急性感染，从而形成肺气肿［15］。在本研究中，CSE 联合气管滴注LPS的方法旨在模拟感染引起COPD 急性发作从而导致肺功能急剧下降及气道黏液高分泌的特点。

气道炎性反应在COPD 的发生及发展过程中具有重要作用。IL-8 和TNF-ɑ 是重要的促炎因子，在机体免疫应答中也发挥作用。促炎因子IL-8在烟草烟雾诱导的肺部炎症调节方面发挥着关键作用［16］。TNF-ɑ可以促进中性粒细胞向肺组织趋化、黏附和渗出，释放弹性蛋白酶，增强氧化反应，从而损伤上皮细胞，导致肺气肿［17］。TNF-ɑ 水平能够反映肺组织的损伤程度，其表达水平的升高与COPD 患者的气道炎症增加和肺功能下降有关，会增加COPD 的病死率，因此可将其作为评价肺损伤的可靠指标［18］。

本实验结果显示，以CSE 和CSE 联合气管滴注LPS 的方法建立COPD 模型后，大鼠血清中IL-8 和TNF-ɑ 表达水平均显著升高，肺功能明显下降，RI、Cchord、FRC均显著升高，TV、MV、FEV50/FVC则均显著降低（P＜0.05）。肺组织病理切片的HE染色结果进一步证实支气管存在炎性细胞浸润，肺泡壁变薄，肺泡腔有不同程度的扩张和断裂；这些结果均证明这两种方法建立的COPD 大鼠模型均成功。而且与单纯烟雾暴露组相比，CSE 联合气管滴注LPS 组大鼠血清中的IL-8和TNF-ɑ表达水平升高更为显著，肺功能下降更加明显，气道壁增厚更加显著，气道炎症更明显，肺泡腔扩张、断裂更为明显。这表明CSE 联合气管滴注LPS 的方法更能促进炎症细胞浸润，导致肺组织气管壁增厚，气流受限，通气能力下降。

综上所述，本实验采用两种方法都能够成功建立COPD大鼠模型，而且CSE联合气管滴注LPS方法建立COPD模型后大鼠肺功能损害、肺组织炎症与人类慢阻肺的临床病理特点更加接近，提示该方法建立的COPD模型可以更好地模拟慢阻肺的病理变化。

[医学伦理声明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有动物实验均已通过广州医科大学附属第一医院实验动物伦理委员会审查批准（No.202040A）。所有实验过程均遵照实验动物相关法律法规条例要求进行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University (Approval Letter No. 202040A), and all experimental protocols were carried out following the guidelines such asAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal: Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892—2018), ARRIVE 2.0, IGP 2012 and IAVE 2010.

[作者贡献Author Contribution]

卢心鹏负责实验操作、分析数据、文章写作；刘蓉负责动物实验操作、给药等；黄文博负责分子生物学实验，数据分析；赵瑾负责动物病理分析；李洪涛负责实验设计指导，文章修改及把关。

[利益声明Declaration of Interest]

所有作者均声明本文不存在利益冲突。