复方卡森糖浆缓解D-氨基半乳糖引起的小鼠急性化学性肝损伤

麦丽开·阿不力米提, 艾山·艾比布勒, 史 深, 阿不都沙拉木·阿不都热依木, 艾尼瓦尔·塔力甫

(1. 新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心, 乌鲁木齐 830002; 2. 新疆维吾尔自治区中医医院老年病科, 乌鲁木齐 830000; 3. 新疆维吾尔自治区维吾尔医院,乌鲁木齐 830000)

维吾尔医药是中国传统医药的重要组成部分，也是我国四大民族医药之一［1］，在临床上广泛用于炎症疾病的治疗［2］。研究表明，维吾尔医学常用药材之一的毛菊苣提取物对小鼠肝纤维化具有一定的保护作用［3］。在维吾尔语中毛菊苣又名卡森新疆地区维吾尔医学应用中主要取卡森地上部分和根入药，味微苦、咸，性凉，清肝利胆，用于治疗湿热黄疸、胃痛食少及水肿尿少［4-6］。

复方卡森糖浆由茴香根皮、菊苣根、玫瑰花、黄瓜子、小茴香、菊苣子、葫芦子仁7 味药材组成，具有通滞利肝、利尿消肿等功能，用于胆液质过盛而引起的各种疾病。目前，临床上该药主要用于肝炎、肝硬化、胆囊炎、带状疱疹、荨麻疹、关节炎等疾病的治疗［7］。虽然相关临床资料已经表明“复方卡森糖浆”具有治疗肝病的效果［8-9］，但进一步研究该制剂的保肝作用机制可为复方卡森糖浆的临床应用提供更多理论基础，并为新药开发奠定基础。

本研究以复方卡森糖浆的保肝作用为切入点，建立D-氨基半乳糖致小鼠急性化学性肝损伤模型，探讨复方卡森糖浆对小鼠血清生化肝功能指标及免疫学水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性ICR小鼠，体质量为18～22 g，由上海斯莱克实验动物有限公司［SCXK（沪）2017-0005］提供，动物质量合格证编号为20170005007808，饲养于新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心实验动物屏障设施［SYXK（新）2016-0001］。动物在实验前一周进行适应性喂养，相对湿度为40%～60%，温度为20～24 ℃，12 h 光照交替，自由饮用净化水，摄食小鼠标准颗粒饲料（江苏省协同医药生物工程有限公司提供的SPF级大鼠小鼠维持饲料）。本研究中动物实验方案经新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心实验动物福利与伦理委员会审查批准（2020-002），所有动物实验操作符合实验动物3R原则及国内外相关的实验动物福利伦理标准要求。

1.2 主要药品与试剂

复方卡森糖浆和炎消迪娜儿糖浆参考标准物均由新疆维吾尔自治区维吾尔医医院制药厂生产，批准文号分别为新药文号M20041581、国药准字Z65020183，规格均为200 mL/瓶。D-氨基半乳糖购自美国Sigma 公司。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）检测用ELISA 试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测用ELISA 试剂盒均购自武汉酶免生物科技有限公司。血清谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性检测试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。HE染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3 主要仪器

AccuteTBA-40FR东芝全自动生化分析仪为日本东芝公司产品；BS323S 电子天平为德国Sartorius 公司产品；SCIENTZ-48高通量组织研磨器购自宁波新芝生物科技股份有限公司；721型分光光度计购自上海第三分析仪器厂。

1.4 动物分组、模型建立及药物处理

按小鼠体质量随机分组，分别为正常对照组、模型对照组、炎消迪娜儿糖浆阳性对照组及复方卡森糖浆低、中、高剂量组，共6组，每组8只。复方卡森糖浆低、中、高剂量组分别按原药液的50%、100%、200%（即用恒温水浴锅加热原药液使之蒸发水分50%，药物浓度增加至原来的一倍）配制药物，按8 mL·kg-1·d-1灌胃，连续7 d［5］。为了证明复方卡森糖浆（新药）的有效性，将炎消迪娜儿糖浆（国药）作为阳性对照标准品。阳性对照组按12 mL·kg-1·d-1给予炎消迪娜儿糖浆灌胃，连续7 d。正常对照组和模型对照组给予同体积的生理盐水。

末次给药1 h后，除正常对照组外，其他各组小鼠均腹腔注射给予D-氨基半乳糖800 mg/kg，建立急性化学性肝损伤模型。然后观察各组小鼠的肝损伤病理变化及血清生化水平。

1.5 用药后小鼠血清生化及免疫学指标测定

肝损伤模型建立24 h 后，腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg）麻醉小鼠。眼球取血［10-11］，常规分离血清并使用试剂盒测定ALT、AST、ALP活性，以此反映肝功能。另外取肝脏组织块（0.1～0.2 g），放入匀浆管中，冰水浴条件下用机械式匀浆机8 000～10 000 r/min匀浆，10 s/次，间隙30 s，连续3～5次。将制备好的10%匀浆液用普通离心机（2 500 r/min）离心10～15 min，取上清液，采用ELISA法测定SOD、GSH-Px、MDA含量，以反映肝细胞损伤程度。

1.6 用药后小鼠肝脏组织病理学观察

动物分组前、解剖前各测量一次体质量，解剖后测量肝脏和脾脏质量，并计算肝脾指数（小鼠肝脏或脾脏质量/小鼠体质量×100%）。解剖后各组小鼠的肝脏组织经质量分数为4%的中性甲醛溶液固定，常规制片。HE染色法观察各组小鼠肝组织病理学变化。

1.7 统计分析

采用SPSS 22软件对各实验结果数据进行分析。所有数据用±s表示。多组样本均数比较，首先采用单因素方差分析，再采用LSD-t检验进行两两比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脾指数测定

与正常对照组相比，模型组小鼠的肝脏指数及脾脏指数均有升高，其中肝脏指数升高具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，复方卡森糖浆低、中剂量组小鼠的脾脏指数（0.26±0.05）、炎消迪娜儿糖浆阳性对照组小鼠的肝脏指数（4.42±0.75）均显著下降（P＜0.05），详见表1。

表1 复方卡森糖浆对D-氨基半乳糖所致小鼠肝、脾指数的影响Table 1 Effect of compound Casson syrup（CCS）on liver and spleen indexes of mice induced by D-galactose（±s,n=8）

表1 复方卡森糖浆对D-氨基半乳糖所致小鼠肝、脾指数的影响Table 1 Effect of compound Casson syrup（CCS）on liver and spleen indexes of mice induced by D-galactose（±s,n=8）

注：炎消迪娜儿糖浆用作复方卡森糖浆的阳性对照药物。与对照组比较，★P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。Note：Yanxiaodinar syrup（YS）was used as the positive control of compound Casson syrup（CCS）. Compared with control group，★P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05.

组别Group正常对照Normal control模型对照Model control炎消迪娜儿糖浆对照YS control低剂量复方卡森糖浆Low-dose of CCS中剂量复方卡森糖浆Medium-dose of CCS高剂量复方卡森糖浆High-dose of CCS剂量Dose/(mL·kg-1·d-1)- - 1 2 4 8 16实验前体质量Pre-test body mass/g 24.00±1.07 25.00±2.39 20.13±3.31 27.50±0.76 22.88±3.36 26.13±0.99解剖前体质量Preanatomic body mass/g 29.19±1.70 28.85±4.88 27.16±2.98 30.99±1.36 28.91±1.75 28.66±1.81肝脏指数Liver index/(mg·g-1)4.95±0.61 5.93±0.84★4.42±0.75#4.50±0.38 5.35±0.83 4.64±0.29脾脏指数Spleen index/(mg·g-1)0.30±0.07 0.36±0.01 0.32±0.05 0.26±0.05#0.28±0.06#0.32±0.06

2.2 肝功能评估

与正常对照组比较，模型组小鼠的血清ALT、AST 和ALP 水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，复方卡森糖浆和炎消迪娜儿糖浆各给药组小鼠的血清AST、ALT 水平均有所下降；而各给药组之间虽有波动，但无显著性差异。与模型组比较，各给药组的血清ALP水平显著下降（P＜0.05），详见表2。结果提示D-氨基半乳糖可致小鼠肝功能下降，而复方卡森糖浆对肝功能具有一定的保护作用。

表2 复方卡森糖浆对D-氨基半乳糖所致化学性肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP的影响Table 2 Effects of compound Casson syrup on serum ALT,AST and ALP of mice with chemical liver injury caused by Dgalactose（±s,n=8）

表2 复方卡森糖浆对D-氨基半乳糖所致化学性肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP的影响Table 2 Effects of compound Casson syrup on serum ALT,AST and ALP of mice with chemical liver injury caused by Dgalactose（±s,n=8）

注：炎消迪娜儿糖浆用作复方卡森糖浆的阳性对照药物。ALT为谷丙转氨酶，AST为谷草转氨酶，ALP为碱性磷酸酶。与对照组比较，★P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。Note：Yanxiaodinar syrup（YS）was used as the positive control of compound Casson syrup（CCS）.ALT is alanine aminotransferase；AST is aspartate aminotransferase；ALP is alkaline phosphatase.compared with control group，★P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05.

组别Group正常对照Normal control模型对照Model control炎消迪娜儿糖浆对照YS control低剂量复方卡森糖浆Low-dose of CCS中剂量复方卡森糖浆Medium-dose of CCS高剂量复方卡森糖浆High-dose of CCS剂量Dose/(mL·kg-1·d-1)- - 1 2 4 8 16 ALT z/(U·L-1)34.63±1.41 101.13±51.3★53.60±10.43 59.63±37.74 45.25±17.80 38.80±4.76 AST z/(U·L-1)144.50±27.30 241.25±41.04★216.20±50.45 182.63±56.29 159.13±31.84 145.80±13.03 AST/ALT 4.18±0.84#2.39±1.69 4.19±1.47 3.44±0.99 3.79±0.95 3.83±0.75 ALP z/(U·L-1)171.50±20.10#217.50±81.39★157.80±17.30#169.13±28.98#173.38±27.64#149.60±24.81#

2.3 抗氧化状态评估

与正常对照组比较，模型组小鼠肝脏组织匀浆中MDA 和GSH-Px 含量增高（P＜0.05），SOD 含量明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，复方卡森糖浆各剂量组小鼠肝脏SOD 含量增高（P＜0.05），其中高剂量组增高明显（P＜0.01）；而MDA 和GSH-Px 含量出现不同程度的降低，有些剂量组的差异有统计学意义（P＜0.05），详见表3。结果提示复方卡森糖浆对D-氨基半乳糖导致的肝细胞损伤具有一定的拮抗作用。

表3 复方卡森糖浆对D-氨基半乳糖所致化学性肝损伤小鼠肝组织MDA、GSH、SOD的影响Table 3 Effects of compound Casson syrup on MDA,GSH,SOD in liver tissues of mice with chemical liver injury caused by D-galactose（±s,n=8）

表3 复方卡森糖浆对D-氨基半乳糖所致化学性肝损伤小鼠肝组织MDA、GSH、SOD的影响Table 3 Effects of compound Casson syrup on MDA,GSH,SOD in liver tissues of mice with chemical liver injury caused by D-galactose（±s,n=8）

注：炎消迪娜儿糖浆用作复方卡森糖浆的阳性对照药物。MDA为丙二醛，GSH-Px为谷胱甘肽过氧化物酶，SOD为超氧化物歧化酶；与对照组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01。与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Yanxiaodinar syrup（YS）was used as the positive control of compound Casson syrup（CCS）.MDA is malondialdehyde；SOD is superoxide dismutase；GSH-Px is glutathione peroxidase；compared with the control group，★P＜0.05，★★P＜0.01；compared with model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

组别Group正常对照组Normal control模型对照Model control炎消迪娜儿糖浆对照YS control低剂量复方卡森糖浆Low-dose of CCS中剂量复方卡森糖浆Medium-dose of CCS高剂量复方卡森糖浆High-dose of CCS剂量Dose/(mL·kg-1·d-1)- - 1 2 4 8 16 MDA ρ/(μmoL·mg-1)0.79±0.10 0.82±0.14★0.74±0.09#0.56±0.18#0.67±0.12#1.09±0.09 GSH-Px ρ/(nmoL·mg-1)25.60±7.79 32.13±9.24★27.27±9.03 30.34±6.51 26.33±10.05 19.82±16.44#SOD z/(U·mg-1)12.23±3.21b 4.37±3.94★★5.78±1.56#7.30±1.53#5.89±1.64#20.16±5.17##

2.4 组织病理学评估

对照组小鼠的肝小叶结构清晰完整，肝细胞无异常（图1A）。模型组小鼠的肝索结构紊乱，有明显的肝细胞灶性坏死，周围有炎性细胞浸润，表明存在急性肝组织损伤（图1B）。阳性组小鼠的局部肝细胞轻度肿大，肝小叶结构无明显异常，提示肝组织损伤得到明显改善（图1C）。与模型组比较，复方卡森糖浆低、中、高剂量组小鼠的肝组织病理损伤得到明显改善（图1D、E、F），表现为肝小叶结构较完整，无明显炎性细胞浸润。

图1 复方卡森糖浆对D-氨基半乳糖所致化学性肝损伤小鼠肝组织病理学影响（HE染色，×200）Figure 1 Effect of compound Casson syrup on liver tissue caseology of D-galactose induced chemical liver injury mice（HE staining，×200）

3 讨论

近年来，由于不良生活习惯和现代社会生活和工作环境，如高压力、久坐、熬夜加班、长期酗酒、摄入高热量食品及慢性病药物的长期使用等因素，药物性肝病、酒精性肝病的发病率明显上升。据统计，2015年我国酒精性脂肪性肝病患者约2 463.5万人，其中40多岁年龄段的人群的酒精性肝病发病率最高，为10%以上［12］；另外，约有25%的人存在非酒精性肝脂肪［13］。化学性有害物质通过胃肠道和血液循环进入肝脏进行代谢，因此肝脏容易受到这些毒性物质的损害，造成化学性肝损伤。肝损伤动物模型类似于人类肝炎发生的病理生理过程，是筛选保肝药物较为理想的研究模型之一。因此，应加强实验与临床应用的结合，注重整体观念与辨证论治，从而充分体现传统医药治疗化学性肝损伤的优势及广阔前景［14］。

本研究通过D-氨基半乳糖诱导建立了ICR 小鼠急性化学性肝损伤模型，模型组小鼠的肝、脾脏指数均显著升高，说明肝脏和脾脏均受到化学物质的影响。其中，炎消迪娜儿糖浆阳性对照组小鼠的脾脏指数偏低应不是毒性反应，而是与当时动物体质量偏小相关。肝功能指标检测数据表明，复方卡森糖浆各剂量组具有保肝作用。本研究表明，复方卡森糖浆给药组小鼠血清中ALT 和AST 水平均明显低于肝损伤模型组，说明中药在降低ALT、AST 以及保护肝细胞方面起到了一定的作用；该结果与以往文献结论［15-16］相一致。进一步评估各组小鼠的抗氧化状态，结果显示模型组小鼠肝组织匀浆中MDA、GSH-Px 值升高，SOD 含量明显降低，并且HE染色后观察发现模型组小鼠的肝组织发生了病理学改变，说明化学性肝损伤模型建立成功。

复方卡森糖浆对肝损伤的修复作用，是因为复方卡森糖浆通过影响肝脏代谢机能，增强抗氧化作用，调节机体免疫，保护受损肝细胞。复方卡森糖浆和炎消迪娜儿糖浆都是临床上用于炎症疾病治疗的主要中药制剂。本研究中同时使用炎消迪娜儿糖浆作为阳性对照，可以证明动物实验具有检验灵敏性，即能够证明阳性药物的有效性。

本实验结果表明，复方卡森糖浆可以有效缓解D-氨基半乳糖引起的小鼠急性化学性肝损伤。本实验以复方卡森糖浆的保肝作用为切入点，研究该制剂的保肝作用可为复方卡森糖浆的临床应用提供理论基础，并为新药开发奠定基础。

[医学伦理声明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有动物实验均已通过新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心实验动物福利与伦理委员会实验动物伦理委员会审查批准（No.2020-002）。所有实验过程均遵照实验动物相关法律法规条例要求进行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Welfare and Ethics Committee of Xinjiang Center for Disease Control and Prevention(Approval Letter No.2020-002),and all experi-mental protocols were carried out following the guidelines such asAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal: Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892—2018), ARRIVE 2.0, IGP 2012 and IAVE 2010.

[作者贡献]Author Contribution]

麦丽开·阿不力米提负责文献查阅和整理，以及文章撰写与修改；艾山·艾比布勒和史深协助完成动物实验，并整理分析数据；阿不都沙拉木·阿不都热依木参与文章思路及整体内容的讨论；艾尼瓦尔·塔力甫负责实验设计与审核，并对全文内容进行指导。

[利益声明Declaration of Interest]

所有作者均声明本文不存在利益冲突。