全细胞膜片钳技术在遗传性长QT 综合征和不明原因猝死中的研究进展

舒俊杰 ，陈红羽 ，刘 凯 ，雷普平

（1）昆明医科大学司法鉴定中心，云南 昆明 650500;2）信阳市中心医院医学影像科，河南 信阳 464000;3）河南圣德司法鉴定中心，河南 信阳 464000;4）昆明医科大学法医学院，云南 昆明 650500）

由基因突变引起的心脏离子通道疾病（Cardiac channelopathy）被认为是引起不明原因猝死（sudden unexplained death，SUD）的首要原因之一，以QT间期延长为主要特征的长QT 综合征（long QT syndrome，LQTS）是常见的易引起心率失常和心源性猝死的心脏离子通道疾病之一[1]。得益于基因分型技术的发展，研究人员[2]在LQTS 患者以及各型SUD 猝死者DNA 中发现了大量心肌细胞Na+、K+、Ca2+离子通道编码基因的突变，而明确此类突变的致病性变得尤为重要。全细胞膜片钳技术（Patch clamp techniques）作为先进的细胞电生理技术，在研究离子通道疾病中的应用日益广泛，尤其是对于LQTS 相关基因突变致病性的评估、SUD 的预防和死亡原因鉴定等方面具有重要意义。本文对全细胞膜片钳技术在LQTS 和SUD 中的应用进行综述。

1 长QT 综合征的研究现状

长QT 综合征是一组以体表心电图QT 间期延长为主要特征、易引发尖端扭转型室性心动过速等心律失常、严重者可导致猝死的心脏离子通道疾病。研究表明[2]，遗传性LQTS 是由KCNQ1、KCNH2、SCN5A等编码心脏Na+、K+、Ca2+等离子通道和（或）相关蛋白基因的突变引起。临床医生在排除外源性因素作用后，根据个体体表心电图QT 间期时长（QTc≥480 ms 或在不明原因晕厥时QTc≥460 ms）并综合评估患者家族史以及多重心电图检测结果进行LQTS 的诊断[3-4]。据报道，LQTS 的发病率约为1∶7 000～1∶2 000，而作为最常见的离子通道疾病之一，LQTS 约占所有SUD 病例的20%～25%，同时LQTS 也是引起儿童和青少年SUD 的主要原因之一[5]。

目前的研究结果已经明确了17 种遗传性LQTS 亚型的致病基因，各致病基因对应的LQTS亚型、影响（离子）电流和主要致病机制，见表1。其中KCNQ1基因和KNCH2基因均编码电压门控K+通道蛋白的α 亚基，二者对应的离子通道分别介导心脏复极化过程中延迟整流钾电流中的慢速电流（IKS）和快速电流（IKr），KCNQ1和KNCH2基因的功能缺失型突变分别通过减少IKS、IKr，延长心脏复极过程导致LQTS1 和LQTS2；SCN5A基因编码电压门控Na+通道蛋白的α 亚基，该离子通道介导心肌细胞复极过程中的晚期内向Nav1.5 电流，SCN5A基因的功能获得型突变通过增加Nav1.5 电流时程，延长心脏复极过程导致LQTS3。据统计，LQTS1、LQTS2 和LQTS3 作为最常见的3 种LQTS 亚型，占所有基因型阳性患者的比例分别为35%、30%和10%[6]，见表1。

表1 长QT 综合征各亚型相关的致病基因和致病机制Tab.1 Pathogenic genes and mechanism of different LQTS subtypes

2 长QT 综合征与不明原因猝死

SUD 是指经法医学尸体解剖、组织病理学检验及其他科学手段全面检验后仍无法明确死因的猝死，现场勘查或案情调查也未发现与死亡有关的证据，这使得SUD 成为法医病理学的工作难点和研究热点之一。

新近研究显示基因突变导致的离子通道疾病已经成为SUD 的罪魁祸首，学者Ackerman[7]在1999 年首次通过基因测序技术对一名在游泳时发生SUD 的19 岁健康女性进行了4 个LQTS 致病基因（KCNQ1、HERG、KCNE1、SCN5A）的分子遗传学筛查，发现该女性KCNQ1基因第1 外显子区存在373-381（GCCGCGCCC）的碱基缺失，明确其生前患有致死性的长QT 综合征。

此后，基于基因检测技术的发展和应用，法医工作者对大量SUD 案例中猝死者的石蜡包埋组织、冻存组织和LQTS 确诊患者的血液样本进行的基因检测发现，大量LQTS 致病基因突变（包含错义突变、移码突变和插入/缺失突变等）可能是导致各型SUD 的遗传危险因子。例如，2013 年Liu Chao 等[8]对120 名散发性不明原因夜间猝死综合征（SUNDS）猝死者血液DNA 的KCNQ1、KCNH2、KCNE1、KCNE2外显子、外显子-内含子交界区进行了死后遗传分析显示，14 个罕见基因突变（MAF ＜ 0.01，包含KCNE1基因1 个、KCNE22 个、KCNH25 个、KCNQ16 个）和14 个单核苷酸多态性（MAF ＞ 0.01，包含KCNE12 个、KCNH25 个、KCNQ17 个）与中国南部SUNDS 的发生有关。另外，2018 年Jia Penglin 等[9]对83例散发性和3 例家庭聚集性云南不明原因猝死（YNSUD）死者的石蜡包埋心肌组织DNA 进行4 个已知LQTS 致病基因突变热点区（KCNQ1第3 外显子、KCNH2第6、7 外显子和SCN5A第28 外显子）基因测序后，结合生物信息学软件PolyPhen-2 进行蛋白质功能预测发现，KCNQ1基因R192L突变致病和KCNH2基因Y597N 致病突变（PolyPhen-2 预测分值 ＞ 0.98）可能与YNSUD 的发生有关。

值得注意的是，既往对SUD 死者和LQTS 确诊患者进行的基因筛查中发现了大量的相关“致病基因突变”，学者们通常依据基于不同原理的生物信息学软件对所检测到的基因突变（碱基/氨基酸替换）进行致病性评估。目前常用的预测软件有SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster、PROVEAN、Mutation Assessor 等，这些软件主要对基因突变位点的氨基酸特性或突变位点及邻近区域的序列保守性等特征进行分析，给出不同预测结果（良性、有害或致病等），例如SIFT 通过进化保守性和位置特异性评分矩阵进行预测；PolyPhen-2 基于进化保守性与蛋白质的三维结构并利用贝叶斯分类器计算后验概率来预测突变的致病性；PROVEAN是依据进化保守性、神经网络模型、BLOSUM62氨基酸替换打分矩阵预测[10-11]，由于不同软件遵循不同原理，所以不同软件对同一突变致病性的预测结果可能有所不同，甚至相差很大，这就导致在缺乏功能验证的情况下只依据生物信息学软件预测结果判定基因突变的致病性，可能无法在携带基因突变的猝死者亲属和LQTS 患者中准确筛查出猝死高危人群，故有必要结合生物信息学软件预测结果对LQTS 相关基因突变进行功能验证试验。

3 全细胞膜片钳技术在LQTS 基因突变致病性验证中的应用

20 世纪70 年代，德国学者Neher 和Sakmann[12]为了记录乙酰胆碱刺激青蛙肌细胞膜产生的离子电流而创建了膜片钳技术（Patch-clamp techniques），它是通过阻抗微电极与细胞膜之间形成紧密接触、采用电压钳或电流钳记录生物膜上一种或多种离子通道的电活动，来研究其门控特性、药理学特性、生理功能以及结构与功能关系等问题的微电极技术。全细胞膜片钳技术作为膜片钳的记录模式之一，可以获得细胞膜上部分或所有离子通道的综合特性，揭示细胞的电生理状态，目前已被学者广泛应用LQTS 致病基因突变在细胞水平的功能验证[13-15]。

目前验证LQTS 致病基因突变功能的方法需联合应用基因克隆、基因编辑等分子生物学技术。对于心脏离子通道疾病而言，可构建稳定或瞬时表达人源LQTS 致病基因突变的细胞系，或者构建转基因动物分离心肌细胞/起搏细胞，再利用全细胞膜片钳来检测突变基因编码Na+、K+、Ca2+离子通道的功能变化。在全细胞膜片钳技术操作中，使用微电极接触浸润于细胞外液中的细胞，给予负压吸破细胞膜形成紧密密封，使细胞内液与电极内液接通，此方法检测结果稳定且对细胞损伤小，已经成为离子通道疾病研究中最重要的技术[15]。

Zhou Xin 等[16]报道了1 例21 岁女性在睡眠中发生SUD 的事件，通过基因筛查发现其祖母、母亲、女儿均携带LQTS 致病基因KCNQ1c.686G＞A（p.G229D）突变，遗传分析推测本案中猝死女性也是该突变携带者，通过定点诱导pEGFP-KCNQ1-N1 质粒产生G229D 突变并转染仓鼠卵巢细胞（CHO-K1），经全细胞膜片钳检测发现G229D 突变通过产生复极后未失活的尾电流导致QT 间期延长和传导延迟，表明G229D 突变可引起携带者心电传导异常和窦房结功能障碍。Furushima 等[17]报道了1 例母亲产后1 个月出现QT 间期延长（QTc ＞ 490 ms），其胎儿在妊娠期间出现2∶1 房室传导阻滞，并于产后1 周QT 间期显著延长（QTc ＞ 521 ms），对母婴进行KCNQ1基因全外显子测序发现2 人均携带KCNQ1-T587M 突变。WuJie 等[17]通过p-GFP 质粒将KCNQ1-T587M 突变转染到稳定表达hERG 蛋白（KCNH2基因编码的K+通道蛋白）的人胚肾细胞中，全细胞膜片钳检测结合荧光能量共振转移技术发现该突变通过降低IKr电流同时干扰hERG 蛋白向细胞膜转运的机制导致长QT 综合征的严重表型。

冯莉等[18]对1 例LQTS 伴晕厥患者（静息心电图QTc：488 ms，动态心电图QTc：610 ms）进行了22 个心脏疾病相关基因外显子及邻近内含子区的遗传学筛查，结果发现其携带KCNH2-F129I突变，应用定点诱导pcDNA3.1-KCNH2质粒突变、脂质体转染人胚肾细胞后，采用全细胞膜片钳技术并结合蛋白质免疫印迹法进行功能和表达研究，结果显示KCNH2-F129I 突变通过干扰hERG 蛋白向细胞膜转运引起通道蛋白减少而导致IKr电流显著减弱，几乎无法单独形成功能性IKr通道。

SCN5A致病基因突变的功能研究报道较KCNQ1、KCNH2基因更多，这可能因为SCN5A基因同样作为Brugada 综合征、病态窦房结综合征等致猝死性心率失常等疾病的致病基因有关。Daniel 等[19]构建了携带人源SCN5A基因野生型和R222Q 突变型的小鼠，通过胶原酶/蛋白酶法从10～14 周小鼠心脏分离获取心肌细胞和浦肯野细胞，利用全细胞膜片钳技术检测两种细胞的钠电流（INa），结果显示R222Q 型小鼠心肌细胞和浦肯野细胞的动作电位时程出现不同程度缩短，其中心肌细胞INa的电导（表示导电能力）明显增大，激活、失活电流以及通道由激活变为失活的“窗电位”均向负极移动；而浦肯野细胞的早期后除级（Early afterdepolarizations）膜电位向负电压方向移动-60 mV，上述改变均与LQTS 的发病机制有关并可能导致个体发生心律失常甚至猝死。

随着人类对离子通道疾病研究的不断深入，膜片钳技术已经成为研究细胞水平电生理的常用技术。而全细胞膜片钳技术在LQTS 患者的遗传学诊断和治疗等方面具有指导价值。对于法医学病理学领域，全细胞膜片钳技术对于评估LQTS致病基因突变的危害性、筛查LQTS 引发SUD 高风险人群以及明确SUD 案例死亡原因等问题均具有重要意义。