AK4 对肝内胆管癌细胞HUCCT1 增殖、迁移的影响

廖周俊，杨少华，刘立鑫，胡 晟，陈轶晖，康 强，张小文

（昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科，云南 昆明 650101）

肝内胆管癌是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤[1]，预后差，近年来，其发病率逐年升高[2]。腺苷酸激酶4（Adenylate kinase4，AK4）是腺苷酸激酶家族的一员，其分子量为25kDa，别称为AK3L1。多项研究显示AK4 促进恶性肿瘤的发生发展[3-5]。但其对肝内胆管癌的作用尚无报道。本实验通过小干扰RNA 手段，就AK4 对肝内胆管癌细胞HUCCT1 增殖、迁移能力的影响作出探究。

1 资料与方法

1.1 细胞系

本实验所用肝内胆管癌细胞HUCCT1 购自上海誉驰生物科技有限公司，该细胞已通过中国科学院昆明动物研究所鉴定明确。该细胞作为肝内胆管癌细胞株之一，常用于肿瘤增殖、迁移的研究。

1.2 小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）转染细胞

本实验采用siRNA 技术以沉默AK4。siRNA购自上海市吉玛基因生物技术有限公司，共计构建6 条si-RNA 序列，序列设计见表1。本次实验分组为空白对照组（CON）、阴性对照组（siRNANC）、阳性对照 组（siRNA-GAPDH）、实验组1（siRNA-AK4-1），实验组2（siRNA-AK4-2），实验组3（siRNA-AK4-3）。转染试剂采用上海市吉玛基因生物技术有限公司GP-transfect-Mate。采用免疫印迹法（Western Blot，WB）对实验组1、实验组 实验组3 进行si-RNA 筛选，其中空白对照组不添加siRNA，阴性对照组基因序列与目的基因序列无同源性，阳性对照组基因序列与内参GAPDH 同源。各组间其余实验操作步骤（转染方法、WB、EdU、细胞划痕实验）均一致。

表1 si-RNA 序列Tab.1 Sequence of si-RNA built by siRNA technology

转染前1 d 将HUCCT1 细胞接种至6 孔板中，以次日细胞融合度达到60%～80%为宜，用无抗生素的完全培养基进行培养。转染：（1）转染试剂室温备用；（2）按照每孔200 µL 无血清培养基（1640 培养基）加5～8 µL 转染试剂配置转染试剂混合物。静置5 min；（3）按照每孔200 µL 无血清培养基（1640 培养基）加150/pmol siRNA 配置siRNA 混合物。静置5 min；（4）将转染试剂混合物滴加到siRNA 混合物中，混匀，静置20 min；（5）20 min 后将混合液均匀加至6 孔板各孔中；（6）各孔另外加入1 600 µL 无抗生素完全培养基；（7）孔板放入细胞培养箱中培养48 h，使用免疫印迹检测转染效率。

1.3 免疫印迹实验检测转染效率及siRNA 筛选

（1）裂解细胞：使用PMSF（品牌：Beyotime，货号：ST506-2 PMSF）与RIPA 裂解液（强）品牌：Beyotime，货号：P0013B）按照200∶1 配置细胞裂解液。于冰上充分裂解细胞；（2）测蛋白浓度：取裂解产物于4 ℃离心机12 000 r/min，离心30 min。吸取86 µL 上清液，使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒（品牌：Beyotime，货号：P0012 500 次）测定蛋白浓度；（3）取80 µL 上清液加20 µL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（品牌：Beyotime，货号：P0015L）沸水加热15 min；（4）电泳：配置12%下层胶，5%上层胶，蛋白上样量为2.5 µg，上层胶60 V恒压电泳，下层胶100 V 恒压电泳；（5）转膜：甲醇浸泡PVDF 膜，胶、膜放置妥当后以300 mA恒流条件下湿转发转膜，时间为30 min；（6）封闭：PVDF 膜置于5%脱脂牛奶中封闭，缓慢摇晃，室温封闭2 h；（7）：孵育一抗：兔单克隆抗体[EPR7678] to AK3L1 抗 体，（1∶7 000，品 牌：Abcam，货号：ab131327）。一抗孵育过夜，4 ℃；（8）：孵育二抗：山羊抗兔IgG（H+L）（品牌：Proteintech，货号：SA00001-2，1∶10 000），室温孵育2 h；（9）显影：ECL 化学发光液孵育1 min后，于成像仪中曝光显影。

1.4 增殖EdU 实验

（1）转染细胞：6 孔板培养细胞。免疫印迹实验已明确siRNA-AK4-3 的沉默效果最好，故本次实验使用siRNA-NC 及siRNA-AK4-3 做细胞转染。分组亦同。转染完成24 h 开始进行EdU 实验。（2）工作液孵育：使用BeyoclickTMEdu-555配置2XEdU 工作液后（品牌：Beyotime，货号：C0075s），与无抗生素完全培养基等体积加入六孔板中，孵育2 h。（3）：固定、染色：每孔1 mL 固定液固定15 min，洗涤后加入通透液孵育15 min，Click 反应液孵育15 min，1X Hoechst 33342 溶液孵育10 min。（4）：荧光检测：洗涤液清洗后于倒置荧光显微镜观察。

1.5 细胞划痕实验

（1）转染细胞：6 孔板培养细胞。本次实验分组为siRNA-NC 及siRNA-AK4-3。转染完成24 h开始细胞划痕实验。（2）画线：使用直尺于6 孔板背面作横行画线。（3）划痕：待细胞融合度为95%～100%时，使用200 µL 枪头沿直尺作垂直于画线的划痕。（4）冲洗：使用PBS 冲洗孔板3 次，动作轻柔，吸净PBS 后，加入无血清1640培养液。（5）拍照：每孔以“十”字交叉处上下为定点，于0 h，12 h，24 h，36 h 拍照，对比不同时间下各组细胞迁移能力，并进行统计分析。

1.6 统计学处理

数据分析使用GraphPad Prism 8 及SPSS 26统计软件，计量资料采用（），计数资料用t检验，3 组及多组计量资料采用单因素方差分析。所有检验取两端。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA 转染效率及筛选

免疫印迹法检测各组后量化结果分别为：空白对照组（CON）：（0.9±0.01，）阴性对照组（siRNANC）：（0.92±0.01），阳性对照组（siRNA-GAPDH）：（0.95±0.04），实验组1（siRNA-AK4-1）：（0.74±0.08），实验组2（siRNA-AK4-2）：（0.45±0.04），实验组3（siRNA-AK4-3）：（0.24±0.02）。免疫印迹结果显示各组内参齐，沉默效果较好，其中阳性对照组对GAPDH 的沉默效果显著。各siRNA组中siRNA-AK4-3 对AK4 的沉默效果最好，见图1，2。因此，后期实验使用siRNA-NC 作为对照组，siRNA-AK4-3 作为实验组。

图1 各组中AK4 蛋白的Western Blot 条带Fig.1 Western blot bands of AK4 protein in each group

2.2 增殖EdU 实验

Edu 实验结果显示：siRNA-NC 组增殖细胞（15.9±4.4）/视野，细胞总数（110.9±22.4）/视野。siRNA-AK4-3 组增殖细胞数目（12.8±5.0）/视野，细胞总数（116.7±22.1）/视野。两组增殖比率有差异，差异有统计学意义。siRNA-NC 组增殖细胞多于siRNA-AK4-3 组，AK4 促进细胞增殖，见图3，4。

图3 中EdU 中增殖的HUCCT1 细胞被标记为siRNA-GAPDH 组为阳性对照，取GAPDH/AK4。各组分别与siRNA-NC 组比较，除CON 组无统计学差异其余各组均有统计学差异。**P＜ 0.01，***P＜ 0.005，****P＜ 0.001。红色荧光，Hoechst 33342 中蓝色荧光标记的为视野下所有活细胞，Merge 图由EdU 和Hoechst 33342 图像合并后得到。

图2 各组细胞中AK4 蛋白的相对表达量Fig.2 The relative expression level of AK4 protein in each group

图3 EdU 检测siRNA-NC 与siRNA-AK4-3 细胞的增殖情况（×200）Fig.3 The proliferation of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells was detected by EdU（×200）

图4 siRNA-NC 组与siRNA-AK4-3 的细胞增殖比率Fig.4 The proliferation rate of siRNA-NC group and siRNA-AK4-3

2.3 细胞划痕实验

划痕实验取划痕面积/视野总面积，各组面积比见表2，差异有统计学意义，见图5，6。siRNA-NC 组细胞迁移面积较siRNA-AK4-3 组更大，AK4 促进细胞迁移。

表2 划痕面积比Tab.2 Scratch area ratio

图5 siRNA-NC 与siRNA-AK4-3 细胞划痕后面积变化，图中红色边缘为Image J 软件勾勒Fig.5 The area changes of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells after scratches，and the red edge in the figure is outlined by Image J software

图6 siRNA-NC 组与siRNA-AK4-3 组细胞划痕后面积占视野总面积比的变化Fig.6 In the siRNA-NC group and siRNA-AK4-3 group，ns represented no difference in the ratio of cell area to total field area after scratches

3 讨论

肝内胆管癌的手术治疗是极其重要的，目前全球范围内术后其平均无瘤生存时间（DFS）为12～ 36 个月[6-7]，但胆管癌起病隐匿，多数患者在发现疾病时已属晚期[8]，据报道，肝内胆管癌的根治切除率为30%～40%，其他肝胆恶性肿瘤均比此数据高[1，9]。肝内胆管癌的辅助化疗（吉西他滨联合铂类）在一定程度上实现肿瘤将期，从而获得手术机会[10-12]，但其中位生存期仍然不到1 a 时间[13-15]。根据Andrew X Zhu 的RCT 临床研究，靶向药物Ivosidenib 使得患者有10.3 个月的中位生存期，而安慰剂组仅有7.5 个月[16]，Abou-Alfa GK 等学者也通过RCT 实验研究了Ivosidenib在胆管癌中的作用，其结果是实验组的无病生存期为2.7 个月（95% CI：1.6～4.2），而安慰剂组的无病生存期为1.4 个月（95% CI：1.4～1.6）[17]。A Demols 也在胆管癌的靶向治疗上进行了RCT 研究，他研究了靶向药Regorafenib 对胆管癌作用，最终得出实验组无病生存期为3.0 个月（95% CI：2.3～4.9），而对照组无病生存期为1.5 个月（95%CI：1.2～2.0），然而实验组的总生存时间和对照组的总生存时间并无统计学差异[18]。可以看出，靶向药能提高患者生存时间，但有研究显示部分靶向药并不能显著提升患者的总生存率[18,19]。因此需寻找一个更有效的作用靶点。

1944 年，美国学者Kalckar 在实验中首次发现了肌苷酸[20]。在随后的科学实践中，更名为腺苷酸激酶AK。AK4 定位于细胞线粒体基质内，在肝脏、心脏、脑、肾脏、胃肠道组织中富于表达[21]，AK4 在细胞能量代谢方面表现出特异性[22]，因此他与肿瘤应该存在相关性。2012 年由台湾地区学者Yi-Hua Jan 完成了首例AK4 与癌症关系论证的研究：体外试验中shRNA 沉默肺癌细胞CL1-5 和A549 中的AK4 后，两株细胞的侵袭能力下降约50%，从而证实AK4 促进肺癌细胞的侵袭[3]。连云港市的学者MinMin HUANG 在研究中显示AK4 在人浆液性卵巢癌组织中高表达。在体内试验中，AK4 敲低组的肿瘤体积明显减小，肿瘤重量明显减轻。这些试验均显示AK4 促进了人浆液性卵巢癌的发生发展[4]。Jie Zhang 等在Her-2 阳性乳腺癌中的研究显示AK4 的表达水平与肿瘤TNM 分期（P=0∶017）和淋巴结转移（P=0∶046）显著相关。体外试验中，MTT 法、细胞划痕实验和Transwell 试验都显示敲低AK4 组的癌细胞增值、迁移、侵袭能力减弱。体外试验也显示敲低了AK4 的肿瘤组织体积减小，重量减轻[5]。此后AK4 与肿瘤的研究未曾断绝，田华等学者通过免疫组化等方法证实了AK4 在肺腺癌中高表达[23]。李辰运的研究显示AK4 在胰腺导管腺癌中高表达，并且与肿瘤分期、淋巴结转移、神经受侵、脉管内瘤栓有相关性（P＜ 0.05）[24]。李绍军等也证实AK4 在食管鳞状细胞中高表达[25]，夏林等也通过免疫组化的方式证实了AK4 在胃癌中高表达[26]，尽管我国的多数学者都明确了AK4 在大多数肿瘤中的表达，但是很遗憾，仅有少数人通过体内、体外实验论证AK4 对相关癌症的影响，无法将他们的研究进一步转化为临床制定治疗方案的依据。

本实验首次论证AK4 对肝内胆管癌细胞HUCCT1 增殖、迁移的影响。首先予siRNA 沉默AK4 的表达，再通过EdU 检测细胞增殖能力，细胞划痕实验检测细胞迁移能力。本次实验的结论与前人的研究结论相似，即AK4 促进肝内胆管癌细胞HUCCT1 的增殖、迁移。本实验的不足在于，笔者尚未完成AK4 对肝内胆管癌细胞其他生物学能力的影响，如EMT、侵袭等等。因此，笔者接下来即将完成其他细胞生物学行为实验，并且探究在机制方面的变化以及通过体内实验验证结论。本实验结论将为肝内胆管癌的临床分子靶向治疗提供基础实验数据，采用生物医学工程技术干预肝内胆管癌组织中AK4 的表达，将有助于肿瘤的综合治疗。