新型蒙药脉泻剂甘露养心丸含量测定及显微鉴别研究

包顺茹 娜仁图雅 乌云索德 高 磊 韩塔娜

内蒙古自治区药品检验研究院内蒙古自治区中蒙药标准研究重点实验室，内蒙古呼和浩特 010010

甘露养心丸为内蒙古国际蒙医院的院内协定处方，由西红花、沙棘、黄芪等29 味药材组成。具有养心、通脉、利尿、平喘、助胃火的功效。主要治疗慢性心力衰竭、水肿、气喘、脉管栓塞等[1-3]。此方在传统脉泻制剂的基础上，对处方进一步优化，使其成为处方药味均为治疗心血管病种的新型脉泻制剂。该制剂突破传统心血管疾病的组方惯例，根据临床病例资料分析，证明其是以利尿，通脉，脉泻为主要方式达到治疗慢性心力衰竭心脏病的效果。该制剂初始标准较低，没有定性、定量标准，为了更好地控制其质量，本研究建立了甘露养心丸中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的总含量测定方法[4-8]及处方中海金沙、沙棘、葶苈子、黄芪、西红花、螃蟹、小蜀季花和山沉香的显微鉴别方法[4.9-17]。该方法为原料药基原、投药量的准确和工艺的稳定提供了保障。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-500DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AE-100 型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；ME 5 型电子天平（赛多利斯仪器有限公司），LEICA DM3000 生物显微镜（德国徕卡）。

1.2 试药

甘露养心丸（内蒙古自治区国际蒙医院，批号：20171204、20181143、20190731、20191229、20200429）。牛蒡子（货号：1704001）、茯苓（货号：1708001）、葶苈子（货号：1712001）、芒硝（货号：1705001）、石榴皮（货号：1704001）、海金沙（货号：1704001）、白豆蔻（货号：1710001）、荜茇（货号：1707001）、香附（货号：1803001）、赤芍（货号：1702001）、肉豆蔻（货号：1704001）、山柰（货号：1508001）、黄芪（货号：1701001）、红参（货号：1703001）、小茴香（货号：1711001）、滑石粉（货号：1705001）、车前子（货号：1711001）、炒蒺藜（货号：1803001）、肉桂（货号：1704001）均购自内蒙古瑞泰药业有限公司；山沉香（货号：C17120701）、赤瓟子（货号：C180606）均购自安国润德药业有限公司；五味子（货号：18033002）购自内蒙古慕昕药业有限公司，白硇砂（货号：170801）；冬青叶（货号：170801）、小蜀季花（货号：170801）、方海（货号：170801）、沙棘（货号：170801）、广枣（货号：170801）均购自安国路路通中药饮片有限公司。西红花苷-Ⅰ对照品（批号：111588-201704，纯度：88.4%）、西红花苷-Ⅱ对照品（批号：111589-201705，纯度：92.2%）购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯，乙醇为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（45∶55）；检测波长为440 nm；流速为1.0 ml/min；柱温为30℃；进样量：10 μl。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ对照品适量，加稀乙醇制成浓度分别为0.259 2、0.100 8 mg/ml 的混合对照品储备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取供试品，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）20 min，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 按处方工艺制备不含西红花的阴性样品，按“2.1.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.1.5 专属性考察 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液，测定。结果显示该方法阴性无干扰，专属性好。见图1。

图1 甘露养心丸、对照品、阴性对照溶液色谱图

2.1.6 线性关系考察 分别精密量取混合对照品储备液0.2、0.5、0.8、1.2、1.6、2.0 ml 置10 ml 量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀。分别测定，以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，西红花苷-Ⅰ在5.184～51.837 μg/ml 范围内，西红花苷-Ⅱ在2.015～20.154 μg/ml 范围内呈良好的线性关系。回归方程分别为：Y=63 385.02X+1 216.36，r=1.000 0；Y=755 36.94X+5 175.98，r=1.000 0。

2.1.7 精密度试验 取供试品（批号：20171204），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6 次。西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ峰面积RSD 分别为0.22%、0.38%，精密度良好。

2.1.8 重复性试验 取同一批号供试品（批号：20171204）6 份，各约0.5 g，精密称定，分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定。西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ总含量的RSD 为1.26%，重复性良好。

2.1.9 稳定性试验 取供试品溶液（批号：20171204），分别于制备后0、4、8、12、16、20、24 h 测定，以西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的峰面积值计，RSD 分别为0.47%和0.83%，提示供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.10 加样回收试验 取同一批号供试品（批号：2017 1204，含西红花苷-Ⅰ0.904 mg/g、西红花苷-Ⅱ0.276 mg/g）9 份，各约0.25 g，精密称定，分别精密加入西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ混合对照品溶液5、10、15 ml（西红花苷-Ⅰ浓度为23.440 μg/ml，西红花苷-Ⅱ浓度为7.039 μg/ml），再精密加稀乙醇20、15、10 ml，按“2.1.3”项下方法进行处理，测定。见表1。结果提示该方法准确度良好。

表1 加样回收试验测定结果（n=9）

2.1.11 样品含量测定 取样品按上述方法操作并测定（n=2），5 批样品的西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的总含量分别为1.180 mg/g（批号：20171204）、1.369 mg/g（批号：20181143）、1.356 mg/g（批号：20190731）、2.641 mg/g（批号：20191229）、2.560 mg/g（批号：20200 429）。

2.2 显微鉴别试验

取5 批次样品，研细，制片，置显微镜下检视。选择镜检率高，专属性强的药材鉴别特征建立了显微鉴别方法。

具体显微特征归属：孢子淡黄色，为四面体、三角状圆锥形，外壁有颗粒状雕纹（海金沙）。盾状毛由数十个单细胞毛毗连而成，末端分离，棕黄色，多破碎成扇形（沙棘）。种皮内表皮细胞黄色，多角形或长多角形，壁稍厚（葶苈子）。纤维成束散离，壁厚，表面有纵裂纹，两端断裂成帚状或较平截（黄芪）。花粉粒无色或淡黄色，呈圆球形，表面有稀疏的细小刺状雕纹（西红花）。不规则碎片淡黄色或无色，表面有的可见细密波状或直或网状纹理（螃蟹）。花粉粒呈圆球形，外壁表面有短刺（小蜀季花）。木射线细胞淡黄色至黄色，径向面观长方形，壁略连珠状增厚，切向面观宽1～2 列细胞，高4～13 列细胞，有的射线细胞含棕黄色物（山沉香）。见图2。

图2 甘露养心丸显微镜下表现

3 讨论

西红花苷是西红花的重要有效活性成分，具有显著的抗心血管疾病的药理活性[18-23]。因此本研究选取西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ作为含量指标来控制甘露养心丸的质量。

在供试品溶液制备过程中，考察了提取溶剂稀乙醇量10、15、20、25、50 ml，随着提取溶剂量的增多，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的总含量也随之增多，但提取溶剂量为25、50 ml 时，含量相差不大，考虑绿色环保经济因素，提取溶剂量定为25 ml。

测得的5 批样品含量数据中，3 批样品含量值较低，可能与原药材来源有关[24-26]，因而在制剂配方中应该保证原药材来源的稳定与可靠，以保障临床治疗效果。

该制剂为所有药材原粉入药，因而建立专属性强的显微鉴别方法即可以有效控制部分药材的质量，检验方法简单易行，且经济实用。