促渗剂对八桂止痛乳膏体外经皮吸收的影响

张锦丽 ，梅佳华 ，廖承成 ，胡 丹 ，黄 虹 ，李元文

（1）丽江市中医医院皮肤科，云南 丽江 674100;2）云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500;3）云南中医药大学第一临床医学院，云南 昆明 650021;4）北京中医药大学东方医院皮肤性病科，北京 100000）

八桂止痛乳膏（原名：消炎止痛散）是根据国家级名老中医刘复兴主任自创外用验方消炎止痛散优化制作而来。其主要组成为桂枝、透骨草、三棱、莪术、八角枫、昆明山海棠、大黄，具有消炎止痛、活血化瘀之功效[1-2]。方中以桂枝为君药。通过临床随机对照试验和小鼠模型的抗炎镇痛作用实验[3]，表明抗炎镇痛是此复方的一大特点，且散剂外用在多年的临床运用中，疗效显著，极大的减轻患者的疼痛。但该方在临床应用过程中仍有诸多不足，为提高患者治疗疾病依从性，在传统中医基础理论的指导下，应用现代制药技术不断优化处方及制备工艺，将此散剂改良为膏剂。前期课题中通过单因素及正交设计等方法已选出最佳基质配方，现为提高中药膏剂中有效成分透过皮肤，发挥更好的临床疗效，处方中加入适合的透皮吸收促渗剂是必不可少的。在便携性和操作性上，进行剂型转化。结合相关文献研究，筛选出氮酮作为本实验促渗剂，制备含促渗剂的八桂止痛乳膏，使药物更持久深层透过皮肤，观察不同浓度的氮酮对八桂止痛乳膏的透皮吸收影响。但由于该中药膏剂里中药物成分复杂，部分有小毒，现阶段难以做到对每种成分进行可控性操作，所以选择该方君药主要成分桂皮醛作为体外经皮实验的检测目标，用以测定有效成分的释放量。为将来不断开发临床新药与研究中医药提供思路及实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1260 Series 高效液相色谱仪（安捷伦公司）；TK-12B 型透皮扩散仪（上海市锴凯科技贸易有限公司）；CP124C 电子天平（奥豪斯仪器有限公司）。

1.2 试药

八桂止痛乳膏；桂皮醛标准品（中国食品药品检定研究院 批号为：110710-201821）；甲醇（天津市风船化学试剂科技有限公司）；石油醚（成都市科隆化学品有限公司）；75%乙醇（昆明远方制品生物有限公司）；生理盐水（昆明南疆制药有限公司），甲醇、石油醚均为分析纯。

1.3 动物

昆明种小鼠，雄性，18～22 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号为SCXK（湘）2019-0004。

1.4 统计学处理

实验数据用SPSS 26.0 软件进行单因素方差分析，以表示。

2 结果

2.1 HPLC 测定桂皮醛含量方法的建立

2.1.1 色谱条件色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5.0 µm）；流动相为乙腈-水（32∶68）；检测波长为290 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 µL。

2.1.2 对照品溶液制备取桂皮醛对照品，称定，加甲醇制成每mL 含桂皮醛0.418 mg 的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备取1 g 八桂止痛乳膏于体外透皮扩散池，取不同时间乳膏透过皮肤到接收介质中的溶液，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性样品溶液的制备取桂枝阴性乳膏，按2.1.3 项下方法取接收介质中的溶液，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.5 专属性考察按2.1.1 项下色谱条件，桂皮醛与其他组分色谱峰均达到基线分离，阴性样品溶液无任何干扰，见图1。

图1 八桂止痛乳膏中桂皮醛HPLC 图Fig.1 HPLC figure of Cinnamaldehyde in the Bagui Zhitong cream

2.1.6 线性关系考察精密称取桂皮醛对照品适量分别配制成0.1045、0.209、0.418、0.836、1.672、2.09、4.18 µg/mL 系列对照品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进样分析，测定不同浓度桂皮醛对照品溶液的峰面积，检测结果见表1。对检测结果进行线性回归，得到的线性回归方程为，结果表明桂皮醛在0.104 5～4.18 范围内线性关系良好，见图2。

图2 桂皮醛线性拟合结果Fig.2 Linear fitting results for cinnamaldehyde

表1 HPLC 测定桂皮醛含量标准曲线Tab.1 The standard curve of Cinnamaldehyde content detected by HPLC

2.1.7 精密度实验分别取0.1045、0.418、4.18 µg/mL 的桂皮醛标准品溶液各3 份，共9 份样品进行精密度实验。按“2.1.1”项下色谱条件进行进样分析，检测样品中桂皮醛的峰面积，结果显示低、中、高浓度标准溶液精密度的RSD 值分别为0.57%、0.27%、0.11%，表明该方法测定桂皮醛含量精密度良好，检测结果见表2。

表2 桂皮醛含量测定精密度实验Tab.2 Precision test for determination of cinnamaldehyde content

2.1.8 稳定性考察精密量取八桂止痛乳膏体外经皮渗透液1.0 mL，0.22 µm 微孔滤膜过滤后分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，测量样品中桂皮醛的峰面积。结果显示样品稳定性的RSD 值为2.80%，表明样品在24 h 内具有较好的稳定性，检测结果见表3。

表3 样品稳定性试验Tab.3 Stability test of samples

2.1.9 重复性考察取八桂止痛乳膏体外经皮渗透样品6 份进行重复性考察，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，检测样品中桂皮醛峰面积，结果显示样品重复性的RSD 值为2.47%，表明该方法测定样品中桂皮醛含量重复性好，见表4。

表4 桂皮醛含量测定重复性试验Tab.4 Repeatability test of the determination of cinnamaldehyde content

2.1.10 加样回收率精密量取八桂止痛乳膏体外经皮渗透接收液样品0.5 mL（含桂皮醛0.43 µg）9 份，分别加入低浓度、中浓度、高浓度的对照品溶液各3 份，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，检测其加样回收率。结果显示低浓度、中浓度、高浓度的标准品分别加入到八桂止痛乳膏体外经皮渗透液中，其桂皮醛的平均加样回收率分别为102.79%、101.76%、100.70%，RSD 值分别为1.51%、1.87%、0.85%。加样回收率计算公式为：加样回收率=（C-A）/B×100%，其中A 为供试品中所含桂皮醛的含量；B 为对照品加入桂皮醛含量；C 为检测到桂皮醛含量，见表5。

表5 加样回收率的测定结果Tab.5 The determination results of sample recovery rate

2.2 体外经皮渗透实验

2.2.1 离体小鼠皮肤的制备昆明种小鼠（18～20 g），雄性，共10 只。适应性饲养24 h。将小鼠固定好，剃去腹部的长毛，然后再用脱毛膏将剩余短毛去除。将其脱颈椎处死后，即刻剪下小鼠去毛部位皮肤，反面平铺，分离皮下组织及脂肪，0.9% 盐水反复冲洗至干净，0.9%盐水中浸入无破损皮肤，在 -20 ℃冷冻保存，备用。

2.2.2 扩散装置与接收介质的选择取备用小鼠的皮肤并解冻，将其固定在TK-12B 型扩散池的一端，使皮肤表层面向供给室，八桂止痛乳膏1 g精密称取置于供给室中，与皮肤紧密接触并涂抹均匀。注满30%乙醇生理盐水溶液至接收室中，使与真皮层紧密接触，（37±0.5）℃，100 r/min 恒速磁力搅拌，分别在0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h 取样3 mL，同时补充相等体积的接收液。用0.22 µm 微孔滤膜过滤样品后，在高效液相色谱仪中注入10 µL，测定其含量，并按公式计算累积渗透量Q=（V总Cn+ΣCn-1V取）/A，其中，V总为扩散池接收室的体积，Cn为第n 个取样点测得的接收液中药物浓度，Cn-1为第n-1 个取样点测得的接收液中药物浓度，V取为取样体积，A 为渗透面积。以不同时间的Q 对t 作图，并对作图后直线部分的Q 对t 进行线性回归，所得斜率视为药物的经皮吸收速率Jss[µg/（cm2·h）]。增渗倍数ER=Jss含透皮吸收促进剂/Jss空白。

2.2.3 八桂止痛乳膏的制备取桂枝粉碎成粗粉，加水浸泡12 h，采用蒸馏法提取挥发油，将挥发油加入无水硫酸钠脱水。药渣与其余5 味药加水煎煮2 次，合并以上药液，浓缩至相对密度1.20 g/mL（60 ℃）。取处方量硬脂酸、液状石蜡、羊毛脂置容器内，水浴加热至融化；另取羟苯乙酯、蒸馏水、三乙醇胺、甘油置于其他容器中加热溶解，再加入处方量的浸膏，搅拌均匀；在同等温度下，将水液以细流均匀、缓慢加入到油液中，同时进行搅拌，直至冷凝，即得八桂止痛乳膏。

2.2.4 不同氮酮浓度对八桂止痛乳膏体外经皮渗透的影响制备含1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮、7%氮酮、10%氮酮的八桂止痛乳膏，再按“2.2.2”项下方法进行操作，以Q 对t 作图，用以考察八桂止痛乳膏在不同氮酮浓度作用下的经皮吸收渗透效果。结果表明，加入5%氮酮乳膏中桂皮醛的Q24和Jss最大，表明八桂止痛乳膏的Jss随着氮酮浓度的增加先增大后减小。含不同浓度氮酮的八桂止痛乳膏累积释放量数据见表6，Qt 图见图3，不同浓度氮酮对八桂止痛乳膏的促渗效果见表7。

表7 不同氮酮浓度对八桂止痛乳膏的促渗效果（n=3）Tab.7 Promoting effect of different concentrations of azone on transdermal permeation of Bagui zhitong cream（n=3）

图3 不同氮酮浓度的八桂止痛乳膏Q-t 图Fig.3 Q -t figure of different concentrations of azone BaGui Zhitong cream

表6 体外经皮渗透实验累积释放量（，n=3）Tab.6 The cumulative release amount of the experiment in vitro transdermal permeation（，n=3）

表6 体外经皮渗透实验累积释放量（，n=3）Tab.6 The cumulative release amount of the experiment in vitro transdermal permeation（，n=3）

3 讨论

本研究结果示，不含有透皮吸收促进剂的八桂止痛乳膏中，桂皮醛累积释放量方程为Q=0.236 5 t+0.599 6，24 h 的Jss为0.24±0.09，加入不同浓度氮酮后Jss均有升高，提示氮酮可促进桂皮醛透皮吸收，从促渗倍数可以看出，乳膏中加入氮酮后均不同程度促进桂皮醛体外经皮渗透，其中含5%氮酮的八桂止痛乳膏促渗效果最好，增渗倍数为阴性对照的2.125 倍。随着氮酮浓度的不断增加，透皮累积释放量及经皮吸收速率反而降低。氮酮浓度过高的八桂止痛乳膏黏稠性增加，可能对某些成分产生一定的抑制作用，不利于桂皮醛的释放，进一步降低了皮肤的水合作用，延缓了皮肤的吸收扩散。

中药软膏的记载最早可见于《山海经》中提及的“羯羊脂”，战国时代也有记录，如膏臊、豕膏等。广泛应用于皮肤美容、肛肠、骨伤科等各个方面。中医学认为外用药物是通过腠理、肌肉等途径，其性味入脏腑，祛邪益气扶正，达到治疗效果，即“药达病所，投之可至”[4]。从吸收角度而言，药物经过皮肤的渗透作用，可以使药效直达患处，局部血药浓度在一段较长时段内保持较高的水平，可通过皮下累积后缓慢释放从局部到达全身作用[5]。皮肤科外用药广泛，剂型多样化，表皮作为主要的药物吸收途径，同时皮肤角质层要求药物具有一定的溶脂性[6]，氮酮可增加角质层细胞间的流动，降低药物扩散阻力，基于以上理论基础，氮酮对亲油、亲水性药物和活性成分等均有显著的促渗作用，药理活性很低，是一类评价较高的促渗剂[7-8]，并适用于成分复杂的中药制剂，故本研究中选择亲脂性、亲水性促渗剂氮酮是可行的。八桂止痛散是国家级名老中医刘复兴教授自创的经验方，本方刘老常临床常常用于治疗带状疱疹、带状疱疹后神经痛等各类皮肤痛证，可达到 消炎止痛、活血化瘀的效果。在云南省中医医院使用数十年，收到良好临床疗效，本课题组为进一步增加八桂止痛散的临床疗效，对原有剂型进行必要的改良，尝试将散剂改进为乳膏剂型，便于患者进行使用，增加依从性。

促渗剂的应用主要在于辅助载体增强其透皮作用[9-11]，有研究表明，联合使用促渗剂可增加中药透皮吸收效果。中药剂型的改良是未来中医药发展的重要途径。值得进一步探索。但过于注重促渗效果时，可能会增加药物本身的毒性、刺激性作用，给局部皮损带来不必要的过敏反应及其他不良反应。故今后需要进一步研究及观察。本实验及前期实验中观察到，八桂止痛散经过剂型改良后，在止痛效果，起效时间等方面均显示出良好的优势。经皮给药方法在药物吸收过程中具有避免肝脏的首过消除效应、延长有效作用时间、避免胃肠道的不良反应等优点[12]。但大部分中药复方中成分复杂，就以此方来说，莪术、大黄中药饮片中含有挥发油成分，本身也可促进复方中其他成分的透皮吸收，而本次检测内容只选取桂皮醛，较为单一，难以真实的反映全方的促渗效果；且实验用离体皮肤的保存办法、性质及状态对药物的经皮渗透效果影响较大[13]。无论在哪一种促进药物经皮吸收的方法上，都在很大程度上的改变了表皮的选择透过性，或打开了新的内外连接渠道，或干扰皮肤角质层的脂质结构，影响了表皮的屏障作用[14]。伴随药物理化性质的不同，透过药物浓度也不一致，同时也不可忽略皮肤角质层的屏障功能与其年龄、性别、环境及部位的影响。

中医外治理论历史悠久，但中药复方成分复杂，疗效广泛，如何增加中草药中有效成分的透过，把握有效药量的透过大小、持续时间，如何削弱有毒成分等，这些问题仍待解决。随着国家对中医药的不断重视，中医药现代化是我国中医药改革的必经之路。中药剂型需要不断完善，经皮给药方法的越来越收到重视，并获得越来越多的关注[15-17]。在中医基础知识的指导下，合理应用现代医学技术，探讨化学或天然促渗剂及乳膏基质对单味或复方中药毒性、药效增减的影响，中药配伍中是否存在相互促渗的作用，对中药药物到达病所进行直接研究，必要时采用病理学手段客观描绘促渗结果，将中医药推向国际化更进一步。