不同负荷有氧运动调控PI3K/AKT信号通路改善Aβ沉积导致的海马神经元损伤

江 曦，邵玉萍

(1.湖北中医药大学 基础医学院，湖北 武汉 430065；2.湖北中医药大学 体育健康学院，湖北 武汉 430065)

AD的发病率与死亡率逐年攀升，在全世界造成严重的社会负担和经济损失[1]。有氧运动可以增加海马齿状回内源性神经前体细胞的增殖并改善了空间学习记忆能力[2]。研究表明[3-4]该机制可能与调节GSK-3β的磷酸化水平，激活磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB/AKT)/糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)通路和 Wnt/β-catenin 信号通路分子对AD大鼠受损突触的协同修复作用有关[5]。运动通过胰岛素样生长因子-1(IGF-1)激活PI3K/AKT信号通路[6]。GSK-3β是AKT的主要底物，AKT对其具有负反馈调节作用。动物研究表明[7]，提高GSK-3β的磷酸化水平作为运动促进认知功能的基础，可以增强海马突触可塑性。在啮齿类动物的研究中发现[8]，跑步运动显著增加了海马齿状回内源性神经前体细胞的增殖并改善了空间学习记忆能力。GSK-3β在静息神经元中具有活性，可以通过抑制细胞中 β-连环蛋白(β-catenin)的表达来介导神经干细胞 (NSCs)增殖和分化中起关键作用的Wnt/β-catenin信号通路[9]。β-catenin的持续作用可以激活海马组织中的NSCs。同时，不同的运动负荷对神经的刺激效果不同，有氧运动可以通过强度依赖的方式调节海马突触可塑性。以上结果表明，体育锻炼可以对海马神经元的退行性病变起到缓解作用，保护大脑认知功能。

尽管随着神经科学的不断发展，运动对改善AD神经可塑性、缓解神经退行性疾病和提高认知功能的研究不断深入，但运动改善AD条件下大脑认知功能的机制仍不十分明晰，不同有氧运动方案对AD大脑认知功能的影响是否存有差异，也还需进一步确认。鉴于此，本研究建立AD大鼠模型，通过4周不同有氧运动方案的干预，观察训练后大鼠海马神经元结构和功能的变化，探讨有氧运动改善海马Aβ沉积可能的分子机制，并比较不同有氧训练方案的训练效果。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物

40只SPF级雄性SD大鼠(220g±20g，12周)购自辽宁长生生物科技有限公司，实验动物合格证号：21076201100222637，许可证号：SCXK(辽)2020-0001。动物的实验过程严格遵守有关动物伦理使用的准则和法规。适应性喂养一周后，将大鼠随机分为4组。假手术组(SHAM组，n=10)双侧海马区内注射生理盐水，动物模型组(AD组，n=10)、低负荷有氧运动组(LOE组，n=10)、中等负荷有氧运动组(MIE组，n=10)双侧海马各注射10mmol/l的Aβ25-35寡聚体溶液5μl，假手术组双侧海马注射等量生理盐水[10]。术后恢复期为7天。

1.1.2 主要试剂及仪器

Aβ25-35冻干粉(ABclone公司)，苏木素(美国Sigma公司),GADPH(杭州贤至生物有限公司)一抗，GSK3b及pGSK-3b (CST公司) 一抗；AKT兔多抗(Bioss)。pAKT ( Affiity公司) 一抗，BAX和Bcl-2(Invitrogen公司)一抗。β-catenin(武汉三鹰技术有限公司)。羊抗兔及羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司) 二抗，Elisa试剂盒(武汉伊莱瑞特公司)。ZH-蓝星脑立体定位仪、ZH型Morris水迷宫、ZH-PT型动物实验跑台(安徽正华公司)； RM 2016轮转式切片机(德国Leica公司)；BX53生物显微镜(日本奥林巴斯公司)；DYCZ-24DN垂直电泳槽、DYCZ-40电转仪(北京六一仪器厂)。

1.2 训练方案

训练计划在手术后第8天开始。根据 Beford等[11]使用的训练计划确定运动负荷。康复期间，SHAM组和AD组大鼠照常喂养，不进行任何训练；LOE组和MIE组大鼠进行中等负荷有氧训练，正式训练开始前进行3天的适应性训练。动物跑台设置坡度为0°，速度为20m/min，连续训练4周。MIE组每周训练6天，每天训练1次，训练时间为第一周15min/d，第二周20min/d，第三周25min/d，第四周30min/d。LOE组进行低负荷有氧训练，即每周训练3天，隔1天训练一次，其余训练安排与MIE组相同。训练结束后进行为期7天的Morris水迷宫测试，行为学测试的最后一天进行取样。

1.3 观察指标

1.3.1 HE染色观察海马病理学形态变化

行为测试后,从腹主动脉抽血后取出大脑置于冰上，分离海马并立即转移至-80℃液氮中保存。其中每组随机抽取3只大鼠取全脑浸入4%多聚甲醛溶液中。真空采血管中的血样在室温下静置2小时，4℃低温离心，分离血清并储存于-80℃冰箱。HE染色观察大鼠海马神经元形态。脱水浸蜡由脱水机完成生物组织脱水。使用徕卡病理切片机将包裹在石蜡块中的蜡浸组织块切片。切片烘干后脱蜡，1%水溶性伊红染色。密封后在显微镜下观察。

1.3.2 透射电镜观察海马神经元超微结构

分离的海马组织切成1mm3大小保存在电镜固定液中。标本先用超薄切片机进行切片，再经戊二醛和锇酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸橼酸电子又重染色，透射电镜观察。

1.3.3 Elisa检测血清IGF-1水平

使用 Elisa 试剂盒测定大鼠血清中的 IGF-1。加入待测样品并结合固定在聚苯乙烯微量滴定板表面的Mouse IGF-1 Capture Antibody，通过酶标显色的OD值间接反映待测抗原的含量。

1.3.4 Western blot检测海马AKT、pAKT、GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin表达水平

组织碎片中加入PMSF和磷酸酶抑制剂，匀浆后冰上裂解。裂解溶液离心，分离上清液并测定其蛋白质含量。提取的蛋白质上清液与缓冲液沸水中混合。上样孔加入制备好的蛋白样品和MAKER，每孔总蛋白量为40μg。电泳后将PVDF膜浸泡在TBST中，并在恒温振荡器中封闭2小时。用密封液稀释相应的一抗，将PVDF膜浸入一抗接种培养基中，4℃孵育过夜。洗涤后将相应的HRP标记二抗与封闭液按比例稀释，PVDF膜浸入二抗培养液中孵育。放入显影液和定影液，对胶片进行显影。扫描胶片并分析灰度值。

1.3.5 Morris水迷宫实验检测大鼠空间记忆能力

每组大鼠在治疗期结束时进行Morris水迷宫空间学习，共5d。游泳池壁为黑色，平台置于水面以下1～2 cm处以确保平台不可见。如果老鼠在规定时间内没有找到平台，实验者将其引导至目标区域。第6天取下平台，进行空间探索实验，测试空间记忆能力。将大鼠置于任何相同入口点的水中，并记录目标象限中停留的时间和大鼠穿过原来平台所在位置的次数。

1.4 统计学方法

使用SPSS 25.0对测量数据进行统计分析，使用方差分析(ANOVA)检验行为测试结果、蛋白表达谱等实验数据的变异性是否具有统计学意义。数据以χ±s表示，p<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4周有氧运动对AD大鼠海马形态的影响

SHAM组大鼠海马神经元排列紧凑，突触丰富，结构清晰完整，尼氏体数量丰富；与SHAM组相比，AD组大鼠CA1区神经元排列疏松杂乱，尼氏体减少，细胞线不清晰；与AD组相比，LOE组和MIE组大鼠海马神经细胞中的尼氏体数量增加，细胞线清晰，细胞间间隙减少，仅见少量细胞变性坏死。其中MIE组树棘突密度大于LOE组。

2.2 4周有氧运动对AD大鼠海马神经元超微结构的影响

SHAM组海马神经元深染，细胞核规则，线粒体等细胞器结构完好，边缘清晰，数量适中，突触结构清晰；与SHAM组比较，AD组线粒体肿胀，部分嵴融合消失，突触结构模糊；与AD组相比，MIE组与LOE组神经元细胞中细胞器损伤均有所减轻，突触数量增加，结构清晰。

2.3 4周有氧运动对AD大鼠血清中IGF-1水平的影响

Elisa结果如图1所示，与SHAM组相比，AD组的IGF-1水平明显下降(p<0.01)；与AD组相比，MIE组与LOE组大鼠血清中的IGF-1含量均增加(p<0.01，p<0.05)。

图1 各组大鼠血清中的IGF-1水平注：与SHAM组相比，▲▲为 p<0.01。与AD组相比， *为p<0.05，**为p<0.01。

2.4 4周有氧运动对PI3K/AKT信号通路与Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白表达的影响

WB检测结果显示(见表1)，与SHAM组相比，AD组Bcl-2/Bax的比值明显下降(p<0.01),而cleaved Caspase3/Caspase的比值上升(p<0.01)，pAKT/AKT的比值下降(p<0.05),pGSK-3β/GSK-3β的比值下降(p<0.05)，β-catenin的表达水平明显下降(p<0.05)；与AD组相比，MIE和LOE组Bcl-2/Bax的比值明显上升(p<0.05),而cleaved Caspase3/Caspase的比值下降(p<0.05)，pAKT/AKT比值上升(p<0.05)、pGSK-3β/GSK-3β的比值升高(p<0.01，p<0.05)及β-catenin的表达水平提高(p<0.05)。与LOE组相比，MIE组大鼠海马中Bcl-2/Bax的表达水平比值升高(p<0.05),而cleaved Caspase3/Caspase的比值下降(p<0.05)，pAKT/AKT比值上升(p<0.05)、pGSK-3β/GSK-3β的比值升高(p<0.05)。

表1 大鼠海马中Bcl-2/BAX 、Cleaved Caspase 3/ Caspase 3、pAKT/AKT 与pGSK-3β/GSK-3β的水平(n=10,¯χ±s)

2.5 有氧运动对AD大鼠学习记忆能力的影响

行为学检测结果如表2所示，与SHAM组相比，AD组的逃避潜伏期显著升高(p<0.01)，目标象限停留时间缩短(p<0.01)。与AD组相比，LOE组和MIE组的逃避潜伏期均下降(p<0.05)，而目标象限停留时间增加(p<0.05)。与LOE组相比，MIE组的逃避潜伏期显著下降。与SHAM组相比，AD组大鼠寻找平台的活动路程更长；与AD组相比，LOE组与MIE组大鼠寻找平台的路程显著缩短。

表2 各组大鼠Morris水迷宫实验结果(n=10,¯χ±s)

3 讨论

3.1 Aβ对大鼠海马神经元的影响

本研究通过Aβ侧脑室注射建立AD大鼠模型，观察各组大鼠的行为学变化、病理学改变和超微结构的差异。与我们的预测一致，对HE染色切片镜检发现AD大鼠模型组中海马突触密度下降，尼氏体减少，细胞排列疏松，透射电镜下可见髓鞘样改变，脂褐素沉积，线粒体肿胀溶解。以上结果表明AD大鼠海马区神经元受到损伤。行为学检测发现，与侧脑室注射生理盐水的SHAM组相比，AD大鼠空间记忆能力也明显下降。这些结果说明了AD组大鼠海马基本模拟了AD的病理状态，在本实验中较好地完成了动物模型的建立。

AD脑中出现的可溶性Aβ寡聚体聚集到神经元突触上被认为是突触毒素，可诱导包括Tau蛋白过度磷酸化[12]，突触损伤[13]以及抑制突触可塑性[14]等多种AD病理改变。根据 Aβ级联假说的观点[15]，Aβ的沉积是引起 AD 发生一系列病理特征和认知特征的首要因素，包括星形胶质细胞和小胶质细胞的过度激活、突触功能紊乱、氧化应激、tau 蛋白的过度磷酸化最终导致神经元死亡和AD 的产生。Aβ不断聚集形成 Aβ寡聚体，最终形成不溶性纤维，沉积在神经元胞体外部形成老年斑。这种级联反应一旦产生就难以逆转[16]。根据这一理论，不难理解很多在临床上Aβ靶向的药物，最终以失败告终。这也在提示我们是否可以寻求一种手段，在级联反应开始之前开始介入，也许运动就是其中之一。

3.2 有氧运动激活PI3K/AKT/GSK-3β信号通路对海马神经元的保护作用

本研究发现对比AD组，4周有氧运动后大鼠血清中IGF-1水平显著提高，海马组织中AKT与GSK-3β磷酸化水平显著提高。说明4周有氧运动对AD大鼠海马中PI3K/AKT/GSK-3β信号通路产生的积极影响。Kim[7]发现，糖尿病模型大鼠在经过12周的跑台训练后，海马组织中AKT、GSK3β的表达受到抑制。而我们发现4周有氧运动后大鼠海马组织中AKT、GSK3β的表达并不受影响，只是其关键位点的磷酸化水平发生改变。由上可知有氧运动在不同的阶段对神经系统PI3K/AKT信号通路产生的影响并不完全相同。另外，不同时间的有氧运动在增强AKT活性、抑制GSK3β活性和降低tau蛋白磷酸化水平等方面效果上是否存在差异，还有待我们作进一步的验证。WB结果还显示，模型大鼠海马中β-catenin蛋白表达水平明显下降，而 GSK-3β 的表达水平明显升高，这说明AD大鼠海马中Wnt /β-catenin信号通路活性明显下降。给予模型大鼠训练后，大鼠海马中β-catenin表达水平升高，而 GSK-3β的蛋白表达水平下降，这说明4周有氧训练可以通过调节GSK-3β的磷酸化间接调节 Wnt /β-catenin 信号通路，HE染色结果显示有氧运动可以增加AD大鼠海马突触密度，因此，课题组推断有氧运动可以通过激活Wnt /β-catenin信号通路改善海马神经元的增殖分化和成熟。而以上检测中，相比于LOE组大鼠，MIE组大鼠的海马中AKT、GSK-3β磷酸化水平更高，β-catenin蛋白表达增加，BAX/Bcl-2比值下降，Caspase3蛋白表达减少。结合行为学与病理形态改变的检测结果发现，相比于低负荷有氧运动，中等负荷的有氧运动能通过激活PI3K/AKT/GSK-3β信号通路更好地抑制海马神经元的凋亡，保护海马神经元突触的结构与功能，促进AD大鼠的学习记忆能力。Kang[17]利用 NSE/htau23模型小鼠研究发现，经过12周的跑台训练后，大脑皮质中PI3K和AKT的磷酸化水平上升。Bayod[18]研究发现，长期的跑台训练能够提高大鼠海马组织GSK3β的磷酸化水平从而抑制GSK3β的活性，并且降低了tau蛋白Ser396位点的磷酸化水平。这是将运动诱发的周围改变与运动对神经发生和认知益处的潜在中心机制联系起来的重要一步。AKT在许多磷酸化 GSK3β 并因此抑制其激酶活性的蛋白激酶中，作为PI3K/ AKT 途径的一部分，由胰岛素，胰岛素样生长因子 1(IGF-1)，表皮生长因子(EGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)或转化生长因子-1β(TGF-1β)等各种细胞外因子激活。IGF-1水平的提高会影响PI3K的含量，进一步招募AKT和PDK1至细胞膜上，促使PDK1磷酸化AKT蛋白，PDK2或mTORC2磷酸化AKT，增强了AKT激酶活性。活化的AKT可以通过磷酸化作用激活或是抑制下游众多底物。通过磷酸化Bad Ser112/136位点、Bax Ser184位点，从而有效阻断Bad、Bax诱导的海马组织细胞凋亡；还可以阻止Caspase-3和Caspase-9的活化，促进p53的失活，阻止线粒体细胞色素C的释放，同样起到抑制神经细胞凋亡的作用。

另外，AKT活化后通过磷酸化GSK3β，从而抑制GSK3β对tau蛋白的磷酸化作用。而tau蛋白作为一种微管相关蛋白，其磷酸化水平的降低增强了该蛋白的稳定性及与微管的结合能力，有效防止神经纤维缠结的形成。最终改善AD脑的神经元损伤。同时GSK-3β是Wnt信号通路的一个重要负调控因子，用锂抑制GSK-3β活性后，β-catenin的水平会增高，激活Wnt信号通路来保护大鼠的海马神经元免受Aβ引起的损伤。Scali[19]在体外大鼠皮质神经元中的研究发现，抑制Wnt/β-catenin信号转导途径，可增加GSK-3β的活性，从而降低β-catenin的水平，并通过下调Bcl-2和上调Bax的表达促进细胞的凋亡。

研究发现[20]，长期的有氧运动可以提高神经系统的调节能力，改善突触可塑性，加快神经冲动传递速度，增强神经元的存活，促进神经系统执行和认知功能等。大脑海马组织中的这些良性改变对于抑制大脑认知功能衰退，提高大脑学习和记忆功能，改善阿尔茨海默病等神经系统退行性疾病有积极作用。这些发现与我们发现的有氧运动对大脑海马组织PI3K/AKT/GSK-3β与Wnt /β-catenin 信号通路的影响相同。

3.3 不同运动负荷对AD大鼠学习记忆能力的影响

行为学结果显示对比AD模型组，4周运动干预后，AD大鼠在空间记忆能力、海马神经元形态、突触结构等多方面均有明显改善。其中与低负荷有氧运动组相比，中等负荷有氧运动组大鼠在Morris水迷宫中表现出更短的逃避潜伏期和更长的目标象限停留时间。表示在中等强度有氧运动训练的前4周，更高的运动负荷更能提高AD大鼠的学习记忆能力。HE染色结果显示，相比于比低负荷有氧运动组，进行中等负荷有氧运动的大鼠海马区突触密度增加，神经元排列更紧密，可推测更高的运动负荷对海马神经元的保护作用更明显。电镜下观察到，两种运动负荷的大鼠对比，中等负荷有氧运动组大鼠的突触形态改善更明显，线粒体的结构比较完整清晰，说明可能在缓解AD脑中突触损伤方面选择中等负荷有氧运动更适宜。

相对于自主跑轮运动，跑台运动的优势在于运动的负荷切实可控，而缺点是使大鼠产生应激反应，应激对AD的防治具有负面影响[21]。有研究表明，AD大鼠经过8周3d/周频率的跑台训练后，对比进行6d/周频率训练的大鼠其海马神经元的尼氏体数量、突触完整性要显著改善[22]。而本研究中水迷宫实验结果表明，有氧运动能改善 AD 小鼠的学习记忆能力，中负荷训练组表现更优。二者结果的不同可能与运动持续时间有关。说明在改善AD认知和病理特征变化上，存在体力活动的剂量反应，一定的体力活动剂量以内体力活动的增加与 AD 风险降低成正比，低于或高于该剂量范围则影响 AD 风险的降低。

4 结论

4周有氧运动显著改善了AD 大鼠海马神经元结构与功能的损伤，其机制可能与有氧运动调节海马中PI3K/AKT/GSK-3β与Wnt /β-catenin 信号通路的协同作用有关。与低负荷有氧运动方案相比，中负荷有氧运动运动方案对改善Aβ沉积导致的AD大鼠认知功能障碍更有效。