基于网络药理学探讨附子甘草配伍治疗慢性心力衰竭的作用机制*

王利勤 熊鸣峰 王腾宇 万海同 熊墨年 吴春红

（1南昌大学第一附属医院 江西南昌 330006；2南昌大学中医十层脉研究所 江西南昌 330006；3浙江中医药大学 杭州 310053；4江西省中医药研究院 南昌 330046）

附 子（Aconitum carmichaeliDebx.）与 甘 草（Glycyrrhiza uralensisFisch）都是传统常用中药。附子首次出现在《神农本草经》的下品中，大毒，性热，归心、脾、肾经，味辛甘，主要有回阳救逆、补火助阳等功效，为“回阳救逆第一品药”；甘草，俗称“国老”，性平，归心、肺、脾、胃经，味甘，主要有益气健脾、缓急止痛、调和诸药等功效[1]。古今医者，一直有从事附子及其相关配伍的研究，如《医理真传》中指出：“附子大辛大热，足壮先天元阳”“非附子不能挽欲绝之真阳”“能补坎中真阳，真阳为君火之种，补真火即是壮君火也”[2]。陶弘景《神农本草经集注》记载道：“俗方每用附子，皆须甘草、人参、生姜相配者，正制其毒故也。”可见附子虽药效峻猛，但是毒性也较大，临床上使用时需同时兼顾其毒性。我们也发现，医者常用药性缓和的甘草配伍附子，用甘草之缓性来减附子之毒及缓其烈性，比如经典方剂四逆汤等。而《伤寒杂病论》《金匮要略》中关于附子的临床应用大约有60条条文，其中炙甘草与生甘草均可与附子配伍，根据需要选择不同炮制方式的甘草，中医四大经典中有关附子甘草配伍的条文奠定了后代附子配伍甘草作为经典药对的基础，并且一直被历代中医学者较好地应用于临床[3]。我们知道，慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure, CHF）是大部分常见心血管疾病的最终病理结局，也是冠状动脉粥样硬化性心脏病的最常见死因之一。在前期研究中，我们课题组发现附子甘草药对对于CHF具有显著的保护作用，但是基于网络药理学对附子甘草配伍对CHF治疗作用的研究尚未见。网络药理学（Network Pharmacology）[4]是指通过生物信息学、高通量组学及计算生物学等多学科融合，根据中药所具有的多组分、多靶点、机制复杂等特点，从系统生物学的角度阐述中药、配伍以及方药的药理作用、治疗作用靶点及相关机制的技术[5]。本研究将借助网络模块及基因本体论（Gene Ontology Biology Process, GO）的分析方法，较系统地阐述附子甘草配伍药对治疗CHF的机制。由于生物体内的蛋白质相互间密切合作，在机体内发挥重要作用。蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction, PPI）是许多生物过程的重要环节，而GO是目前认为对PPI的解释较有力的方法之一[6]。本研究将应用网络药理学对附子甘草这一经典配伍药对对CHF的治疗作用进行探析，分析其作用机制。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 附子、甘草主要活性成分及成分靶点的收集为了收集“附子”与“甘草”的化学成分及成分靶点，我们选取中医药系统内比较全面的数据库进行搜索。其中TCMSP数据库（http://lsp.nwsuaf.edu.cn）是一个常用的用于分析中药成分药理学的中医药数据库，主要可用于查询常见中药的化学成分[7]。我们在TCMSP数据库输入“附子”“甘草”作为关键词进行检索，再根据该数据库的相关搜索结果，结合其他参考文献的研究方法[8]，并将口服利用度（Oral Bioavailability, OB）≥30%和类药性（Drug-likeness, DL）≥0.18作为筛选条件，最后筛选得到附子有效中药成分为21个，甘草有效中药成分为92个。为提高我们检索结果的准确性，我们同时选用TCM数据库（http://tcm.cmu.edu.tw/）[9]，也输入“附子”“甘草”作为关键词进一步检索。通过将上面2个数据库中所收集的化学成分进行整理，再输入STITCH数据库（https://www.stitchdata.com/），一个用于检测已知的以及被预测的化合物和蛋白质之间相互关系的平台，对“附子”与“甘草”化学成分的成分靶点进行归集。

1.2 CHF的疾病靶点收集为了收集CHF的疾病靶点，我们选取用于研究人类遗传病以及基因的知识库OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）数据库（http://www.Omim.org）[10]以及Gene Card（http://www.genecards.org/）数据库。分别在这2个数据库内以“Chronic Heart Failure”为关键词进行检索，收集与CHF相关的疾病靶点，去除重复数据后再整理所有靶点数据。

1.3 网络构建根据收集的“附子”与“甘草”化学成分及成分靶点、慢性心力衰竭疾病靶点，再参考相关文献中的研究方法[11]，应用生物信息分析软件Cytoscape 3.6.1分别构建“附子”与“甘草”的成分靶点网络、成分靶点相互作用网络，以及CHF的疾病靶点相互作用网络，并构建上述药物成分靶点与疾病靶点的相互作用网络。在构建“附子”与“甘草”成分靶点网络时，将“1.1”整理的数据导入Cytoscape 3.6.1软件即可得成分靶点网络图。在构建“附子”与“甘草”成分靶点相互作用网络和CHF疾病靶点相互作用网络时，我们使用用于基因网络构建的可视化分析Bisogenet插件，将方法设置为“Input nodes and its neighbors”，参数为1，输出方式定为基因。将构建疾病靶点网络图的方法设置为“Input nodes only”，通过软件获取“附子”“甘草”的成分靶点与CHF的疾病靶点相互作用网络图；再应用Bisogenet插件中的Merge功能，取得以上所获网络图的交集部分为“附子”配伍“甘草”治疗CHF的作用靶点候选点。

1.4 通路整合与分析将“1.3”所取的候选点制作韦恩图并进行相关分析，了解CHF的靶点和“附子”与“甘草”潜在靶点的交集，共筛选获得154个交点。再将所获的靶点交集点进行GO富集分析，同时利用基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）进行相关通路注释分析，并根据富集结果，获得有关条形图。相关通路的蛋白质相互作用信息可从具有检索可能靶点预期作用的网络数据库STRING 9.1（http://string-db.org）中获取[12]，筛选条件是OB≥30%，DL≥0.18。该数据库获取的数据可信度高，具有实时更新的功能，同时可进行信度评分。为了进一步分析药物及疾病之间的作用靶点，我们选择Cytoscape 3.6.1软件中的分析聚类系数、度分布及连接组件等参数[13]，基于拓扑参数，与随机网络参数相比，进行网络无标度、小范围和模块化等特性分析。拓扑参数信息是分析可视化合成组织与结构复杂网络的有效信息[14]。经过以上拓扑参数信息分析，我们进一步对PPI进行模块划分，为了获取更精确的靶点信息，我们设置网络中蛋白质节点连接度的临界值为大于3。

2 结果

2.1 相关成分、疾病靶点的收集TCMSP数据库中的靶点附子17个，甘草92个；TCM数据库中的靶点附子19个，甘草92个。利用STITCH数据库对TCMSP及TCM数据库收集所得的化合物进行成分靶点收集，发现有靶点的化合物共为81个，其中相对应的成分靶点为169个。以“Chronic Heart Failure”为关键词在OMIM、Genecard这2个数据库中进行检索，获得相关疾病的靶点共8 668个。疾病的靶点和药物潜在靶点的交集有154个。见图1。

图1 疾病的靶点和药物潜在靶点的韦恩图

2.2 成分靶点与疾病靶点蛋白相互作用网络在该网络中，外圈分子红色（除标注#及▲外）是来源甘草的，蓝色（标注#）是附子的，黄色（标注▲）的是两者共有的。内部的靶点红色（除标注*外）是甘草的作用靶点，黄色（标注*）的是共有的靶点，也就是说，黄色的靶点也是附子的靶点，即甘草的靶点包含了附子的靶点。见图2。

图2 附子-甘草配伍药对成分靶点和慢性心力衰竭相关靶点相互作用网络

2.3 蛋白质与蛋白质的相互作用（PPI图制作）首先我们将差异基因与STRING数据库中比对，获得差异基因的互作关系，并使用Cytoscape（http://www.cytoscape.org/）绘制相互作用网络图。见图3、表1。

图3 附子-甘草-CHF相关靶点蛋白相互作用网络

表1 附子-甘草-CHF相关靶点蛋白相互作用网络

2.4 计算PPI每个节点的度值对3个相互作用的网络进行网络合并后，共获得节点154个，即附子-甘草对治疗CHF的候选靶点共154个。见图1。对候选靶点进行度值（Degree）评价，计算每个节点的度值，选择结果靠前的20条。见图4。

图4 部分候选靶点的度值

2.5 通路整合分析将上诉数据分析结果进行GO富集分析，GO富集分析结果主要包括分子功能、生物过程及细胞组成3个部分[15]。其中，在分子功能方面，附子配伍甘草主要是通过蛋白结合、核苷酸结合等方式对CHF产生保护作用；在生物过程方面，附子配伍甘草主要是通过抗凋亡、抗氧化、抗磷酸化等过程影响CHF的治疗。结果中P值越小，表明该基因在GO中富集越多。见图5、图6。

图5 附子-甘草配伍药对候选靶点的部分GO富集分析（柱状图）

图6 附子-甘草配伍药对候选靶点的部分GO富集分析（气泡图）

2.6 KEGG通路分析在所筛选到的前20条通路中，包含有14条疾病相关通路及5条信号通路[肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、细胞凋亡、C型凝集素受体信号通路、EGFR 酪氨酸激酶、Th17细胞分化）]。见图7、图8。

图7 附子-甘草配伍药对候选靶点的部分KEGG通路分析（柱状图）

图8 附子-甘草配伍药对候选靶点的部分KEGG通路分析（气泡图）

3 讨论

网络药理学是从系统生物学和生物网络学两方面共同来解释疾病发生发展过程的一种研究方法，该方法通过对中药成分及作用靶点来探讨附子配伍甘草治疗CHF的可能机制。通过研究，我们发现附子-甘草配伍药对共收集到81个化合物，对应的成分靶点为169个，同时通过对CHF的检索得到8 668个对应靶点，通过制作韦恩图了解到附子-甘草配伍药对的潜在靶点与CHF的疾病靶点有154个交集。我们在对筛选的154个候选靶点进行GO与KEGG分析时发现，抗氧化过程与治疗CHF的关系密切。已经有研究者发现CHF大鼠的心肌氧化损伤增加，而通过抗心肌氧化损伤可以发挥对CHF大鼠的心肌保护作用[16]。在CHF大鼠中黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase, XO）活性和脂质过氧化产物丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量升高，通过降低心脏XO活性及MDA含量，改善心肌水肿、坏死及纤维化损伤，改善CHF的病理变化，从而发挥抗CHF的作用[17]。同时了解到在冠心病导致的CHF患者中，ERK磷酸化水平提高，可通过抑制其磷酸化从而达到保护心肌组织、改善心功能的作用[18]。除此之外，在进行KEGG通路注释分析时，发现TNF信号通路、细胞凋亡相关信号通路的P值较小，被显著富集。有研究发现，TNF在缺血、缺氧等病理条件的刺激下可显著升高，同时可通过降低TNF水平减轻心力衰竭时心肌损伤程度[19]。同时，叶超等[20]通过对CHF患者的观察了解到对TNF的抑制明显利于患者的恢复，表明TNF在CHF的治疗中具有重要意义。

我们知道，细胞凋亡途径在CHF的治疗中也起到至关重要的作用。有研究表明，在CHF病理过程中，细胞凋亡水平明显升高，通过降低细胞凋亡水平，可在CHF大鼠体内产生明显的抗心衰效应，保护心肌细胞病理损伤、改善心肌细胞功能[21]。同时也有研究表明可通过调节CHF时PTEN/Akt/mTOR和ERK1/2信号通路，改善心肌细胞凋亡水平，进而发挥心肌保护作用[22]。

我们通过PPI度值的分析了解到AKT、IL-6、MAPK与CHF关系密切。众所周知，AKT是重要的细胞因子，往往通过上游因子的调节进而对下游因子产生调节作用从而发挥作用。而Bcl2/Bax明显受到PI3K/AKT信号通路的调节，通过降低AKT磷酸化水平抑制细胞凋亡，进而发挥抗CHF的作用[23]。同时也有研究表明，在大鼠CHF模型中，可通过激活PI3K/AKT信号通路进而发挥抗CHF的作用[24]。通过调节PTEN/Akt/mTOR信号通路可抑制细胞凋亡，进而发挥抗CHF的作用[22]。诸多研究均表明AKT在CHF的发生发展过程中起到重要作用。而白介素-6（IL-6）是体内细胞因子的重要成员，它可刺激C反应蛋白（CRP）的生成，是一种重要的炎症介质。在心肌细胞损伤时，IL-6的表达明显上升，而通过降低IL-6的表达，可显著改善心肌细胞功能，从而达到保护心肌的作用[25]。而钟鸣等[26]通过探讨CHF患者血清IL-6及TNF-α水平获悉，在CHF患者血清中IL-6和TNF-α水平明显增高，表示在CHF的发生发展过程中IL-6和TNF-α发挥了至关重要的作用。在治疗CHF的过程中，血清中TNF-α、IL-6水平在药物的治疗作用下显著降低，说明炎症介质TNF-α、IL-6在CHF的发生发展过程中有非常重要的作用[27]。MAPK信号通路是细胞外信号传导的共同通路，几乎与生物体中全部病理生理过程相关，尤其是氧化应激等细胞反应过程，在CHF模型大鼠中可见MAPK磷酸化水平升高，而抑制MAPK蛋白磷酸化，激活PPAR-γ通路，通过参与线粒体生物合成，可调节线粒体数量和质量，促进能量生成，改善心脏能量代谢，进而减缓CHF的病理进展[28]。但是也有研究表明，抑制MAPK/ERK1/2通路可能通过抑制心肌自噬过程，进而在CHF模型大鼠中发挥心肌保护作用[29]。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法预测了附子-甘草治疗CHF的主要机制，推断附子-甘草配伍药对可能通过调节AKT、MAPK相关信号通路，进而影响IL-6、TNF等细胞因子的表达，改善心肌细胞凋亡水平，从而发挥心肌保护作用。但由于所选数据库的信息可能尚不够完全，该研究也还存在一些局限性，需要在今后的研究中进一步阐明附子配伍甘草活性成分的作用靶点，从而更深入地探讨其对CHF的作用机制。