洗腿又方治疗骨关节炎的网络药理学研究*

张婷 曾建伟 陈俊 戴雨婷 郑若曦 吴广文,2#

（1福建中医药大学中西医结合研究院 福州 350122；2福建中医药大学中西医结合学院 福州 350122；3福建省中西医结合老年性疾病重点实验室 福州 350122）

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是常见的慢性退行性骨关节病，患病率与人口老龄化和肥胖率呈正相关，在中国60岁以上人群中OA发病率更是高达42.8%[1]。OA的病因是多因素的，包括遗传和环境因素。它的主要特点是关节软骨退化，主要表现为膝关节及其邻近组织出现退行性改变[2]。常见的临床表现为关节肿胀、剧痛、僵硬、畸形和不同程度的活动受限等[3]。这与中医学的“痹证”表现类似，系由于风寒湿邪所致，患者出现肢体疼痛或功能障碍等主要症状，多见于50岁左右患者。现代医学对该病的治疗，晚期采用人工关节置换术，早中期主要根据症状进行相应治疗，虽可暂时缓解症状，但长期应用非甾体类抗炎药胃肠道反应较频繁，容易复发[4~5]，且不能彻底治愈OA[6~7]。因而挖掘新的治疗方法迫在眉睫。洗腿又方，出自清宫《慈禧光绪医方选议·光绪皇帝四肢病医方》，组方为酒归尾、青风藤、宣木瓜、赤芍、透骨草各9 g，防风4.5 g，水煎，熏洗患膝关节[8]，经临床检验治疗效果显著，由于其是熏洗的给药方式，使其具有安全、稳定和高接受度等优点，但此方法对于患者而言仍不便捷。因此，如何有效利用现代生物技术来使中医药的临床运用更加高效便捷是一个亟待解决的问题。本研究利用生物信息学、网络药理学和分子对接技术等方法，探索该方的潜在治疗靶点和信号通路，以期为OA的后续治疗和高效便捷的新药开发提供了方向和理论依据[9]。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 筛选骨关节炎的差异表达基因在GEO（Gene Expression Omnibus, GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.）检索“Osteoarthritis”筛选获得GSE82107芯片数据和其基因注释文件GPL570。共17份滑膜组织活检样本，其中10份为OA患者滑膜组织活检样本，剩余7份为健康滑膜组织活检样本。运用R语言中的多阵列平均分析算法进行背景校正，再将基质数据归一化处理。通过Limma包分析差异基因表达，筛选条件设为P＜0.05，差异倍数（Foldchange, FC）＞2。最后利用GGplot2包生成差异表达基因的原始火山图和热图。

1.2 洗腿又方中的中药活性成分及相应靶点的获取采 用 TCMSP（https://tcmsp-e.com/）、HERB（http://herb.ac.cn/） 和 TCMID （http://www.megabionet.org/tcmid/）数据库搜集洗腿又方中各药物的活性成分及其作用靶点，根据外用药物经皮吸收的特点，设置筛选条件为：类药性（Drug-likeneee, DL）≥0.18，分子量（Molecular Weight, MW）≤500，脂水分配系数对数值（AlogP）在1~3之间，获得活性成分及其作用靶点，并通过蛋白质序列数据库（UniportKB, https://www.uniprot.org/uniprot/）对靶点蛋白进行标准化注释。

1.3 疾病与药物交集靶点的获取运用R语言中的Draw Venn Diagrams程序包处理1.1和1.2中获取的疾病靶点和药物靶点以获取交集靶点，并导出Venny图。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络的构建将洗腿又方治疗OA的靶点导入Cytoscape 3.8.2软件中，运 用 STRING、HPRO、BIND、DIP、MINT、INTACT和BIOGRID等数据库对结果进行网络拓扑分析，得到蛋白互作网络。采用CytoNCA插件对以上结果进行拓扑学参数分析和筛选，筛选标准为用度中心性DC（为网络中与靶点相关的靶点数量，DC值越高可认为与其相关的靶点数越多）大于2倍中位数，中介中心度BC（为经过一个靶点最短路径的数量，BC值越高说明网络中经过该靶点最短路径的数量越多）大于1倍中位数，得到疾病相关靶点，最后采用CytoNCA根据网络节点的拓扑属性，筛选获取关键靶点。

1.5 GO和KEGG通路富集分析及KEGG关系网络的构建DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）是生物数据库，包括功能注释、可视化和富集通路等功能。首先将关键靶点导入DAVID数据库进行富集分析，再运用R语言的GGplot2程序包绘制GO分析条形图和KEGG富集分析气泡图，其中气泡越大代表信号通路中富集到更多基因。最后使用Cytoscape 3.8.2软件制作KEGG关系网络。

1.6 分子对接首先从Pubchem数据库（http://zinc.docking.org/）获取1.4中关键活性成分的结构，并用ChemBio3D软件优化结构，以mol2格式保存。在PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载目标蛋白的PDB格式文件，并用PyMol软件优化结构。然后通过Autodock Tools获取活动站点的中心和框的大小等对接信息。运用Autodock-vina1.1.2进行分子对接计算，最后使用PyMol软件对活性成分和目标蛋白的对接结果进行可视化展示。

2 结果

2.1 OA的差异基因芯片GSE82107原始数据文件包括17份滑膜活组织样本，通过R语言将其中10份OA患者的滑膜活组织样本与7份健康个体的滑膜活组织样本进行比较分析。共得到2072个显著改变和受影响的基因，包括1 191个上调节基因和881个下调节基因。并以火山图和热图的形式展现。见图1、图2。

图1 火山图

图2 热图

2.2 洗腿又方中的药物活性成分依据DL≥0.18，MW≤500，AlogP在1~3之间，获得候选活性成分，并结合文献资料，最终确定活性成分。共筛选得洗腿又方中药物的活性成分34个，其中赤芍9个，当归2个，防风12个，木瓜2个，青风藤3个，透骨草6个。见表1。

表1 洗腿又方中药物的活性成分

2.3 洗腿又方治疗骨关节炎的有效成分-靶点网络图的构建应用R语言的Draw Venn Diagrams程序包获取疾病与药物的交集靶点30个，并导出Venn图。见图3。通过对TCMSP数据库中目标预测模型的配对分析，获得有相应靶点的20个有效成分。然后用Cystoscape 3.8.2构建洗腿又方治疗骨关节炎的有效成分-靶点网络图。见图4。

图3 Venn图

图4 洗腿又方有效成分-靶点网络图

2.4 蛋白－蛋白相互作用（PPI）网络图的构建将洗腿又方治疗OA的靶点导入Cytoscape 3.8.2软件中制作PPI图，得到疾病相关靶点1 531个，靶点与靶点相互关系25 214个，再进一步采用CytoNCA根据网络节点的拓扑属性经DC值筛选后排除无关节点得到疾病相关靶点215个，靶点与靶点相互关系5 547个，最后经BC值筛选后得到关键靶点71个，靶点与靶点相互关系1 099个。见图5。

图5 PPI图

2.5 GO和KEGG通路富集分析及KEGG关系网络的构建在DAVID数据库中进行GO和KEGG富集分析，其中GO生物过程（BP）分析结果主要富集在对氧水平降低的反应和对机械刺激的反应等方面。见图6。GO分子功能（MF）分析结果主要表现在细胞因子活性、泛素样蛋白连接酶结合活性和受体-配体活性等方面。见图7。GO细胞组分（CC）分析结果主要涉及细胞器外膜、细胞外膜和线粒体外膜等方面。见图8。KEGG富集分析结果主要涉及P53信号通路、白细胞介素-17信号通路和内分泌抵抗等信号通路。见图9、图10。

图6 洗腿又方治疗OA的基因本体论数据库生物过程分析图

图7 洗腿又方治疗OA的基因本体论数据库分子功能分析图

图8 洗腿又方治疗OA的基因本体论数据库细胞组分分析图

图9 洗腿又方治疗OA的关联信号通路分析图

图10 KEGG关系网络图

2.6 分子对接分析根据洗腿又方活性成分-靶点网络图与蛋白互作中的Degree值，选取关键活性成分芹黄素（apigenin）与关键靶点HIF1A、关键活性成分槲皮素（quercetin）与关键靶点CASP8，进行分子对接。结果表明，两种活性成分与目标受体蛋白的结合能均小于-5 kJ/mol，表明2种分子与目标受体结合良好。见图11、图12。

图11 芹黄素（apigenin）-HIF1A

图12 槲皮素（quercetin）-CASP8

3 讨论

目前，临床治疗OA的常用药物有非甾体类抗炎药、止痛药（阿片类药物和非阿片类药物）、对症慢效药物以及局部给药制剂，而外用药物的使用最大程度避免了口服药所带来的一系列不良反应，如减少了胃肠道不适和心血管方面不良事件[10]。但此类药物依然只能暂时缓解症状，未能完全治愈疾病[11]。因此，如何提高疗效成为临床研究中亟待解决的问题。目前西医对晚期OA尚无特效药物。中草药因其疗效显著、不良反应少等优点，在OA治疗中的优势日益凸显。

洗腿又方出自清宫，疗效显著，共六味药。酒归尾，性温味甘，能活血化瘀，加以酒制，助其辛散，更能发挥其效；木瓜性温味酸，舒筋通络；赤芍性酸味苦，能敛阴止痛，并能化瘀；青风藤、透骨草均能祛风湿以利关节，且入肝肾两经，可为引经药；防风性微温味辛、甘，可祛风通络。OA，中医之“痹症”，乃血虚风湿入络所致，故选用祛风湿药木瓜、青风藤、透骨草、防风以祛风除湿、通利经络，更兼当归、赤芍补血活血，标本兼治，且其为外用熏洗药，经皮吸收，可使药物直达病所。经临床实践检验，疗效显著，具有安全稳定和接受度高等优势[12]。

本研究基于网络药理学的方法筛选获得洗腿又方的活性成分，其中芹黄素、槲皮素、汉黄芩素、黄芩素等为洗腿又方治疗OA的关键活性成分。芹黄素是一种具有多种药理特性的天然黄酮，有抗炎、抗氧化、保护软骨和抗肿瘤等作用。研究发现芹黄素可使IL-1β显著降低，还可以使SOX-9、胶原蛋白2琢1和蛋白聚糖的表达水平增加，可减轻氧化应激、抑制炎症和促进细胞外基质成分产生以预防OA[13~14]。还有研究表明芹黄素以浓度依赖的方式完全阻断IL-1β诱导JNK磷酸化和NF-κB降解（代表Hif-2α表达的关键途径），提示芹黄素可作为新型Hif-2α抑制剂治疗OA[15]。槲皮素是一种典型的天然植物黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、免疫调节和抑制关节滑膜组织增殖等多种生物活性，对减缓OA的病程有一定的作用。有研究表明槲皮素有26种与OA相关的靶蛋白，这些靶标主要集中在线粒体ATP合成，质子转运以及一氧化氮的生物合成等过程中[16]。同时有研究表明槲皮素可显著抑制基质降解蛋白酶和炎症介质，减轻氧化应激、内质网应激和软骨细胞凋亡从而发挥软骨保护作用[17~18]。还有研究表明在槲皮素治疗的OA大鼠中，TLR-4和NF-κB的表达以剂量依赖性方式被显著抑制[19]。综上所述，洗腿又方中的活性成分可通过抑制炎症，抗氧化和保护软骨基质发挥治疗OA的作用。

根据DAVID对洗腿又方治疗骨关节炎的HIF1A、CASP8、RAF1、APLN、RANKL、WISP1、IL-7等关键靶点的富集分析发现，洗腿又方通过干预炎症、细胞周期和内分泌等通路发挥了治疗OA的作用。在炎症相关通路方面，IL-7刺激的IL-7R成熟B细胞发挥促炎作用[20]。OA的恶化与浅表和中层软骨区的TLR免疫染色增加之间存在相关性[21]。在细胞周期相关通路方面：滑膜诱导的血管生成是OA发病机理的核心，APLN参与OA发病机理和血管生成[22]；可通过调节RANKL信号通路发挥对OA的治疗作用[23]；WISP1可以通过调节OA中的αvβ3受体和PI3K/Akt信号通路来保护软骨细胞的衰老和凋亡发挥治疗OA的价值[24]。RAF1/MEK/ERK信号通路及其磷酸化参与OA软骨细胞的增殖[25]。在内分泌相关通路方面：在OA成骨细胞中THRα敲低后，这些THR下游基因VEGF、HIF-1A和IGF-1被下调，提示局部抑制THRα可能是治疗OA的潜在靶标[26]。已有研究证实通过shRNA介导的关节组织FSHR下调阻断FSH信号能有效延缓OA的进展[27]。同时分子对接结果表明，芹黄素和槲皮素可能通过靶向调控HIF1A、CASP8等核心靶点抑制OA的进展。本研究通过生物信息学、网络药理学和分子对接等方法探讨了洗腿又方治疗OA的关键基因及分子机制，为OA的潜在治疗靶点提供了新参考，为其机制寻求新突破点，也为中药开发指明了新思路与方向。