Fscn2基因过表达对顺铂诱导的耳蜗细胞凋亡的抑制作用

王 岩 商文静 韩锋产

滨州医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，山东省医药卫生耳科遗传病重点实验室 山东 烟台 264003

Fscn2是Fascin家族的一员，Fscn2可与F-actin交联成刚性平行的纤毛束[1]。Perrin等[2]研究DBA/2J增龄性聋小鼠发现，Fscn2与β-actin相互作用维持了小鼠的静纤毛长度和听觉功能。Yang等[3]研究发现，DBA/2J小鼠耳蜗细胞凋亡导致其早期听力减退，通过抗凋亡治疗可减轻耳蜗细胞的凋亡。敲低Fscn2基因增加了肾小管上皮细胞对顺铂诱导细胞凋亡的易感性。Fscn2在C2细胞【敲低α(E-Catenin的NRK-52E细胞)】中的过表达降低C2细胞对顺铂诱导细胞凋亡的敏感性[4]。这些研究表明，Fscn2不仅是一种结构蛋白，还具有调节细胞命运的功能。

顺铂是一种高效的抗肿瘤药物，广泛应用于各种癌症的治疗，包括头颈部癌、胃癌等[5]。但在接受顺铂化疗后，约40%～80%的成人和至少50%的儿童出现永久性的听力损失[6]。顺铂的耳毒性在临床上主要表现为双侧、渐近性和不可逆的感音性神经听力损失[7]。本研究旨在探讨Fscn2基因的过表达对顺铂诱导耳蜗细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 HEI-OC1(house ear institute-organ of corti 1)耳蜗细胞来自豪斯耳科学研究所(House Ear Institute)。血清购自Gibco公司(货号为16140-071)；高糖购自Hyclone公司(货号为SH30023.01)；嘌呤霉素购自Meilunbio公司(货号为MA0318)；Rabbit Anti Bcl-2 antibody购自Proteintech公司(货号为26593-1-AP)；FITC-Annexin V试剂盒购自BD公司(货号为556547)；Anti C-caspase3 antibody购自CST公司(货号为9505)。

1.2 实验方法

1.2.1 慢病毒感染耳蜗细胞 构建表达Fscn2病毒载体(主要原件见表1)包装慢病毒颗粒。培养HEI-OC1细胞(33℃，10% CO2)，当贴壁率达到30%～40%时可进行慢病毒感染。将细胞培养液、慢病毒、慢病毒感染增强液按照989∶10∶1的比例混匀，配制成慢病毒感染培养液。以换液形式加入六孔板，培养箱培养24 h后取出，弃除慢病毒感染培养液，1×PBS清洗2次，加入细胞培养液(2 mL/孔)。培养48 h后，加入含6 μg/mL嘌呤霉素的培养液筛选得到Fscn2稳定表达株。

表1 Fscn2病毒载体结构

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖率 构建外源性Fscn2过表达载体，包装病毒颗粒，感染耳蜗细胞，获得Fscn2过表达的耳蜗细胞模型(以下简称为Fscn2-o/e细胞)。同样方法获得对照组细胞，即E.V.细胞。收集E.V.细胞和Fscn2-o/e细胞并计数，按5 000细胞/孔加入96孔板中，补培养液至100 μL，混匀，放入培养箱中培养24 h后，吸掉96孔板中的培养液并用PBS洗2次。以换液的方式加入含有顺铂的培养液，顺铂浓度为30 μM。培养24 h后，配置含10%WST-8【化学名为2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐】的培养液，以换液的形式加入96孔板(100 μL/孔)。设置空白孔，只含10% WST-8的培养基，放入培养箱2 h后，96孔板放入酶标仪中，测定顺铂干预的E.V.细胞和Fscn2-o/e细胞在450 nm处吸光度并计算细胞存活率。细胞存活率=顺铂干预细胞的OD值/顺铂未干预的细胞的OD值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 进行E.V.细胞和Fscn2-o/e细胞培养，收集细胞，离心去上清，加入1 mL培养液重悬细胞。六孔板每孔加300 μL细胞悬液，再加700 μL培养液混匀细胞，放入培养箱。待E.V.细胞和Fscn2-o/e细胞长满，以换液的方式加入含有顺铂的培养液，顺铂浓度为30 μM。培养24 h后，收集细胞(包括悬液中的细胞)，按 1∶9 稀释结合缓冲液得到1×结合缓冲液。用1×结合缓冲液悬浮E.V.细胞和Fscn2-o/e细胞，调节其浓度约为1×106/mL。分别取100 μL的E.V.细胞和Fscn2-o/e细胞悬液于2 mL EP管中，加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI混匀，室温避光孵育15 min。加入400 μL PBS，转移至5 μL 流式管中立刻放入流式细胞仪(Bekmancoulter EPICS-XL,美国)进行流式细胞检测。

1.2.4 Western Blot 将E.V.细胞和Fscn2-o/e细胞接种到6孔板。待E.V.细胞和Fscn2-o/e细胞长满后(约24 h)，以换液的方式加入含有30 μM顺铂的培养液。培养24 h后，收集E.V.细胞和Fscn2-o/e细胞加入裂解液(PMSF∶RIPA=1∶100)80 μL，静置10 min，震荡15 s。在4 ℃下，12 000 r/min离心15 min，收集上清。BCA法测定蛋白浓度，计算上样量。配制10%的SDS-PAGE凝胶，分别将顺铂干预的E.V.细胞蛋白样品和Fscn2-o/e细胞蛋白样品加入梳孔中，电压设置为110 V进行电泳120 min。将蛋白样品转到PVDF膜上，电流为200 mA，时间为110 min。将PVDF膜放入封闭液中，封闭2 h。一抗(抗Fscn2、Bcl-2、Cleaved caspase-3的抗体)用TBST稀释。将一抗稀释液加入密封袋中，放入PVDF膜，封口，4℃摇床上孵育过夜。第二天将膜取出，用TBST快速洗10 min，重复3次，用TBST将按照1∶5 000的比例稀释二抗，室温摇床慢速孵育2 h，用ECL化学发光检测系统检测结果。

2 结果

2.1Fscn2过表达耳蜗细胞模型的鉴定 Western blot对构建的Fscn2过表达耳蜗细胞进行验证，结果显示，Fscn2-o/e细胞的Fscn2蛋白的表达量高于E.V.细胞(图1)。

两组比较，**P<0.01。

2.2Fscn2过表达耳蜗细胞增殖能力的检测 构建细胞模型后，用顺铂进行干预。结果显示，在30 μM的顺铂干预24 h之后，与E.V.细胞比较，Fscn2-o/e细胞的增殖能力显著增强，P<0.01(图2)。

两组比较，**P<0.01。

2.3Fscn2过表达耳蜗细胞凋亡率的检测 用30 μM顺铂处理Fscn2-o/e细胞与E.V.细胞24 h，再用流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示，在顺铂干预下，E.V.细胞的Q2(早中期凋亡细胞)区域细胞占比为12.8 %，Q4(晚期凋亡细胞)区域细胞占比为12 %，而Fscn2-o/e细胞Q2区域细胞占比为7.4%，Q4区域细胞占比为9.3 %(图3A)。统计分析显示，在顺铂干预后，E.V.细胞与Fscn2-o/e细胞的凋亡率比较，P<0.01(图3B)。本研究提示，Fscn2的过表达能显著抑制顺铂所致的耳蜗细胞凋亡。

A为流式细胞术检测细胞凋亡率；

2.4 Western blot检测Fscn2过表达耳蜗细胞凋亡相关蛋白的表达 为进一步研究在顺铂干预下Fscn2过表达耳蜗细胞凋亡率降低的机制，本研究通过Western blot对凋亡相关蛋白进行检测。结果显示，30 μM顺铂干预24 h后，与E.V.细胞相比，Fscn2-o/e细胞抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达较高，而凋亡相关蛋白Cleaved caspase3水平较低(图4)。本研究提示，Fscn2-o/e细胞可能通过调节Bcl-2和Cleaved-caspase3的水平以对抗顺铂诱导的细胞凋亡。

两组比较，*P<0.05。

3 讨论

顺铂诱导耳毒性的详细机制尚不完全清楚，目前认为包括DNA损伤、活性氧(reactive oxygen species，ROS)过量生成和细胞凋亡在内的多种机制与此有关[8-9]。顺铂进入细胞后，造成DNA损伤[10]，引起毛细血管扩张性共济失调症突变(ataxia-telangiectasia mutated，ATM)。ATM可以激活肿瘤抑制基因p53，增加促凋亡相关蛋白Bax的表达，后者增加线粒体膜的通透性，使细胞色素C从线粒体释放，导致caspase 3的活化[11]。用30 μM的顺铂干预24 h后，HEI-OC1细胞的存活率下降约50%，Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)的表达降低。用Nrf2激活剂—叔丁基氢醌(tertiary butylhydroquinone，TBHQ)对细胞进行处理，细胞中非线粒体ROS的积累减少，抑制了细胞的凋亡[12]。此外，α-硫辛酸(alpha lipoic acid，ALA)、海藻糖、小檗碱或黄连素等小分子药物可抑制顺铂诱导的耳蜗细胞凋亡[13-15]。

顺铂可通过诱导细胞凋亡通路发挥其耳毒性[16]。蛋白质精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferase，PRMT3)和大麻素系统的相互作用与顺铂诱导的耳毒性有关，PRMT3和大麻素系统的相关蛋白脂肪酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase，FAAH1)的过表达调控顺铂诱导的HEI-OC1细胞凋亡相关蛋白的水平(如Cleaved-caspase3的表达升高)[17]。顺铂还可通过使脂质过氧化物、铁元素的堆积以及线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)的下降以诱导HEI-OC1细胞的铁死亡，最后引起细胞凋亡[18]。铁死亡的抑制剂ferrostatin-1能够改善顺铂诱导的HEI-OC1细胞凋亡以及耳蜗外植体中线粒体的功能[19]。在顺铂干预下，注射了AAV2-Pou4f3 shRNA的小鼠耳蜗中凋亡相关蛋白Bax水平升高，而抗凋亡相关蛋白Bcl-2水平降低。这提示，在顺铂处理后，Pou4f3的低表达可能增加耳蜗细胞的凋亡[20]。使用氯喹阻断自噬可以改善顺铂诱导的HEI-OC1细胞的铁死亡，这表明，通过铁死亡诱导的细胞死亡与细胞的过度自噬有关[21]。Fscn2还能改善顺铂所致的肾小管上皮细胞的凋亡[22]。

综上所述，为进一步研究Fscn2的过表达是否抑制顺铂诱导的耳蜗细胞凋亡，本研究构建了Fscn2过表达的耳蜗细胞模型。本研究发现，在顺铂的干预下，Fscn2-o/e细胞的增殖能力较高，而细胞凋亡的水平较低，凋亡相关蛋白表达水平较低。这表明，Fscn2基因的过表达抑制了顺铂诱导的耳蜗细胞凋亡，Fscn2可能是对抗顺铂诱导耳蜗细胞凋亡的重要因素之一，但详细机制有待进一步研究。本研究利用Fscn2基因过表达的细胞模型探讨Fscn2对顺铂诱导耳蜗细胞凋亡的影响，为揭示Fscn2基因的功能提供实验依据。