慢性阻塞性肺疾病患者与健康人群肠道菌群差异的比较

焦倩倩 闫俊红 高福泉 翟乃亮 袁 飞 逯 峰 潘 磊

滨州医学院附属医院 山东 滨州 256003

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系统疾病中的常见病和多发病，患病率和病死率均居高不下，给病患家庭带来了沉重的经济负担，同时也增加了社会负担[1-2]。我国目前COPD患者约有1亿人，20岁及以上成人患病率为8.6%，40岁以上则达13.7%，60岁以上人群患病率已超过27%[3]。目前，虽然常用的支气管扩张剂等可一定程度上改善患者生活质量、减轻呼吸困难、提高运动能力等，但常因为价格昂贵、患者吸入药物不规范甚至药物潜在的副作用等原因，大大限制了其临床普及应用。因此，进一步探明COPD的发病机制并寻求新的治疗方法对于防治 COPD 具有重要的临床意义。近年来研究发现，肠道菌群与支气管哮喘[4]、肺部感染[5]、囊性纤维化[6]、肺结核[7]等肺部疾病的发生发展也有关联。本课题以COPD患者及健康志愿者为研究对象，借助高通量测序技术对肠道菌群进行16S rRNA基因测序，对比COPD患者与健康人群肠道菌群的物种组成和丰度水平，探讨肠道菌群在COPD发病中的潜在作用及其机制，期望为防治COPD提供新的治疗策略。

1 对象与方法

1.1 研究对象 随机选取2018年6月至2019年12月来我院呼吸与重症医学科门诊或住院的COPD患者作为试验组(COPD组)，健康家属作为对照组(健康组)。健康家属为患者的子女或配偶。本研究通过滨州医学院附属医院伦理委员会批准(批号为2018-2017WS366-01)，所有患者均知情同意。所有患者均接受常规治疗，包括采用吸入激素+长效β2受体激动剂或胆碱能受体抑制剂及祛痰剂等药物。

1.1.1 纳入标准 ①COPD诊断符合2017年GOLD指南标准[1]，即吸入支气管舒张剂后第1秒用力呼气量(forced expiratory volume in the first second，FEV1)与用力肺活量(forced vital capacity，FVC)的比值<70%；②1月内未使用抗生素、微生态制剂。

1.1.2 排除标准 ①有精神功能异常；②有消化系统疾病、哮喘、支气管扩张、肺结核等疾病； ③过敏体质；④有严重肾、心、肝功能障碍。

1.2 研究方法

1.2.1 粪便标本采集和肠道细菌DNA的提取 采集清晨新鲜粪便标本0.5 g，要求避免尿液、灰尘等污染,选取无污染的部分，置入厌氧罐内。标本采集后标记姓名、编号，-80°冰箱保存备用。使用粪便DNA提取试剂盒从粪便样本中提取肠道微生物DNA，参照Wang等的方法[8]进行。

1.2.3 16S rRNA鉴定和生物信息学分析 利用Illumina Miseq测序平台，对细菌的16SrRNA基因V3～V4区进行高通量测序。对测序结果进行生物信息学分析：通过质量初筛的序列按照引物和Barcode信息，识别分配入对应样本，并去除嵌合体等疑问序列；对获得的序列进行操作分类单元(operational Taxonomic Unit，OTU)归并划分，每个OTU的代表序列用于分类地位鉴定以及系统发育学分析；根据OTU在不同样本中的丰度分布，评估每个样本的多样性水平，并通过稀疏曲线反映测序深度是否达标；对各样本(组)在不同分类水平的具体组成进行分析(并检验组间是否具有统计学差异)；通过多种多变量统计学分析工具，进一步衡量不同样本(组)间的菌群结构差异及与差异相关的物种；根据物种在各样本中的组成分布，构建互作关联网络。

2 结果

2.1 研究对象的人口学特征 最终获得COPD组有效样本22份；对照组有效样本21份(1份样本因污染不合格被丢弃处理)。COPD组22例患者，其中男13例，女9例，年龄为(68.4±7.9)岁；对照组健康家属为21例，其中男11例，女10例，年龄为(54.1±12.9)岁。健康家属为患者的子女或配偶。两组年龄比较，P<0.05，而性别差异无统计学意义。所有COPD患者病情评估为C和D组，其中，14名患者已戒烟1年以上，8名患者无吸烟史。

2.2 OTU划分和分类分析 两组不同样本总的OTU数和分类鉴定结果提示“种”上对照组显著多于COPD组，差异有统计学意义；其他“门”“纲”“目”“科”“属”上比较对照组比COPD组丰富，但差异无统计学意义(图1)。两组个体样本的OTU数和分类鉴定结果显示，COPD1-22代表22个患者，COPD1.1-21.1代表患者的21名健康家属(图2)。

图1 两组总的OTU划分和分类分析

图2 两组个体样本的OTU数和分类鉴定结果的差异比较

2.3 两组肠道微生物群落的α多样性分析 表1表明肠道微生物群落的α多样性，其中反映物种数目指标为Chao1指数和基于丰度的覆盖估计值(ACE)，

表1 两组患者肠道微生物群落的α多样性比较

反映物种丰度指标为Shannon指数，反映物种均匀度指标为Simpson指数。结果显示COPD组的Chao1、ACE及Shannon指数低于对照组，Simpson指数高于对照组，提示COPD患者肠道菌群多样性不如对照组，但两组各指数间差异均无统计学意义。

2.4 两组肠道菌群属分类水平上的分类组成和丰度比较 图3横坐标依据样本名排列，每一个柱形图代表一个样本，并以颜色区分各分类单元，纵坐标代表各分类单元的相对丰度，柱子越长，该分类单元在对应样本中的相对丰度越高。结果提示COPD组肠道菌群中拟杆菌属丰度较对照组高，而COPD组中本来肠道菌群中优势菌群Faecalibacterium(柔嫩梭菌群)却减少。

图3 两组肠道菌群属分类水平上的分类组成和丰度比较

2.5 两组结合聚类分析的群落组成热图 将各分类水平的群落组成数据根据分类单元的丰度分布或样本间的相似程度加以聚类，并通过热图加以呈现。通过聚类，可以将高丰度和低丰度的分类单元加以区分，并以颜色梯度反映样本之间的群落组成相似度。图4中红色代表在对应样本中丰度较高的属，绿色代表丰度较低的属。

图4 两组结合聚类分析的群落组成热图

3 讨论

本研究通过对COPD患者与其健康家属肠道菌群进行比较，发现COPD组与健康对照组的肠道菌群有差异，COPD患者的肠道菌群丰度和均匀度均降低，提示COPD患者的肠道菌群的多样性下降。

肠道菌群是一类定植在人体肠道内的微生物，它们数量及种类多，正常成人肠道菌群约有500～1 000种类型，细胞总量约为人体自身细胞的10倍，肠道菌群相关编码的基因数量至少是人体自身基因的100倍[10]。肠道菌群对人体具有重要的生理功能，可以影响机体的营养代谢、调节免疫系统功能、发挥抗菌作用等[11]。从人体发育学上讲，遵循结构与功能的统一原则，宿主的结构基础，决定了其功能与病理的内在联系；肠道菌群微生态失衡必将关联着相似同源结构的病理改变。研究证实，胃肠道和肺有一个共同的胚胎起源[12]。Harding等[13]研究发现，胚胎内胚层是肺发育的起始部位，从内胚层腹侧膨出的憩室样结构慢慢形成气管，而消化道表皮也由内胚层发育而来，原肠内胚层分化为呼吸道上皮和腺体。肠道是机体最大的免疫器官，肠道菌群构成和功能的改变通过共同粘膜免疫系统影响到呼吸道，而呼吸道菌群紊乱也通过免疫调节影响到消化道，这种肠道和肺部相互影响的作用称为“肠-肺轴”[14]。肠道菌群微生态是机体内环境稳定的重要保障。肠道菌群微生态失衡时，肠源性内毒素的释放以及肠道菌群移位引起的炎性介质释放，均能直接或间接的促进COPD的发生发展；同样，研究表明COPD发生发展过程中，诸多因素(如滥用抗生素)导致肠道菌群微生态失衡或肠道菌群紊乱。因此，“肠-肺轴”可能在COPD中发挥重要作用[15]。

越来越多的证据强调了肠道菌群对肺的影响，然而其潜在的途径和机制仍不清楚。本研究中对COPD患者和健康对照组的粪便微生物组进行了16S rRNA基因测定，发现在两组总的OTU划分和分类 “种”的水平上，COPD组显著少于健康对照组，差异有统计学意义；而在“门、纲、目、科、属” 的水平上COPD组低于对照组，但差异无统计学意义。另外，两者肠道菌群的α多样性分析表明COPD组肠道菌群物种丰度和均匀度均低于对照组。这同国内冉丕鑫团队发现颗粒物质暴露24周后COPD模型大鼠肠道菌群的丰度和多样性减少的报道基本一致[16]。两组肠道菌群中COPD组较对照组的拟杆菌属丰度高，而原本肠道优势菌群柔嫩梭菌群却减少，这可能与COPD的发病和疾病进展有关，未来研究将进一步证实它们与COPD之间的因果关系。最近的一项研究对COPD患者和健康对照组的粪便微生物组进行了对比分析，发现两组间分布不同的几个物种，包括链球菌和毛螺菌科成员，这可能与肺功能的降低有关[17]。本研究纳入患者为C或D组的急性加重患者，而且部分患者因为病情重，并没有进行肺功能检查，因此并没有分析菌群与肺功能的关系，在未来的研究中将进一步分析肠道菌群失调和肺功能下降之间的关系。

本研究也有局限性。首先，研究样本量较小，可能影响结果的可靠性。因此，未来进一步增加样本量进一步证实我们的发现。第二，本研究纳入直系亲属或生活习惯相似的家属作为对照组，以便减少基因遗传和饮食等对肠道菌群的影响，然而仍然不能完全消除两组之间的差异，尤其年龄的差异对肠道菌群的潜在影响[18]，而这些差异可能导致两组人群肠道菌群多样性的不同。第三，研究证实肥胖和粪便样本的一致性与肠道微生物群变化有关[18]，然而本研究没有评估患者体重指数及粪便样本比如粘稠度等的一致性，这些也可能影响本眼肠道菌群的结果分析。

综上所述，COPD患者与健康人群的肠道菌群存在差异，COPD患者肠道菌群的多样性可能减低，这可能与COPD发病和疾病进展有关，两者之间的因果关系尚不清楚，未来研究将进一步探讨肠道菌群与COPD疾病严重程度之间的关系。鉴于本研究的局限性，还需要进一步开展大样本的试验尤其基础研究来探讨肠道菌群在COPD患者中的变化和发病中的作用，以期为防治COPD提供新策略。