失眠穴方合脐内环穴针刺对PCPA 模型大鼠海马5-HT1AR、5-HT2AR 表达的影响*

李文康，罗本华，李玉秋

广西中医药大学，广西 南宁 530001

原发性失眠指慢性、反复发作的睡眠障碍[1］。长期失眠可导致免疫力下降，影响患者的生活质量，但其发病机制尚不明确，中枢5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是较为公认的影响睡眠质量的物质之一。目前关于5-HT 受体表达及相关的递质含量的研究样本较少。已有实验报告：脑内5-HT1A受体在海马区及中缝核区域呈高密度分布，激活该受体可同时增加深睡眠和浅睡眠，以此起到抗失眠的作用；5-HT2AR 与Gαq/11 偶联，作用之一是使磷酯酶C 被激活；5-HT2A受体表达的增多则会抑制慢波睡眠、导致失眠不同程度的加重。失眠方合脐内环针刺是近年新创的临床有效治疗失眠症的针刺验方[2］，已取得临床疗效验证、神经行为学支持及中枢5-HT 递质机制证据。本研究进一步就5-HT 受体进行实验研究，旨在探讨失眠症中5-HT1AR、5-HT2AR 在海马区的表达机制。现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物选择PF 级SD 雄性大鼠46 只，平均体质量（250±15）g，由广西医科大学动物实验中心提供。饲养条件：同等条件下分笼饲养，室温20～26℃，相对湿度为40%～60%，白昼循环模式下自然光照，定时喂食，自由饮水，预养15天。

1.2 药物及试剂对氯苯丙氨酸（para-chlorophenylalanine，PCPA，Thermo 赛默飞）；二甲苯（国药集团化学试剂有限公司，批号：10023418）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：10009218）；3%H202（国药集团化学试剂有限公司，批号：10011218）；封闭山羊血清（Solarbio，批号：SL038）；DAB显色试剂盒（Solarbio，批号：DA1010）；苏木素（G1140，批号：SL038）；中性树胶（G8590，批号：SL038）。

1.3 实验仪器DM1000型正置显微镜（徕卡显微系统有限公司）；移液器（型号：P2、P10、P20、P100、P200、P1000，吉尔森P 型移液器公司）；DHG-9023A型恒温烘箱（上海一恒科学仪器有限公司）；RM2235 型石蜡切片机（徕卡显微系统有限公司）；TKD-TK 型摊片机（湖北康强医疗器械有限公司）；TB-718L 型生物组织包埋机-冷冻机（泰维科技）；TKD-TSB 型组织脱水机（湖北康强医疗器械有限公司）；TB-718D 型石蜡包埋机（湖北康强医疗器械有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及造模 将50只SD大鼠采用随机数字表法分为正常组10只、预用模型组40只。预用模型组采用腹腔注射PCPA 法造模。先用弱碱性生理盐水（pH7-8）按45 mg/mL规格备用。于上午8∶30～9∶00将大鼠按l mL/100 g体质量腹腔注射PCPA混悬液，每天1 次，连续注射2 天。在第2 次腹腔注射PCPA 28～30 h 后，观察并记录大鼠的行为学变化及神经症状。造模成功表现：大鼠白天出现躁动不安，夜间仍活动不停，昼夜交替变化消失，对外界的声、光等自然刺激反应强烈，轻易不让实验者抓摸，饮食与二便显著增多，进食快，饮水多，大小便明显增多，亢奋不停，对同类及实验人员的攻击欲望很强，大便色偏发白，整体与空白组差异明显。造模成功大鼠选出30 只，按随机数字表法分为模型组、针刺组、非穴组3 组，每组各10 只。正常组腹腔注射相同体积的弱碱性生理盐水，连续注射2日。

1.4.2 干预方法 于造模成功第2 天开始干预治疗，每天1次，共6次。1）针刺组：予失眠穴方加脐内环针刺治疗，每穴留针30 s，单次治疗时长7 min。具体方法如下：（1）脐内环穴针刺：选脐内环穴。以大鼠神阙穴[3］为中心，距离2.5 mm 做一圆，正上为心，右为肝，左为脾胃，左上、右上均为肺，共6个点。针刺方法：以毫针（0.25 mm×25 mm）倾斜15°刺入，深度2～4 mm，针后不行捻转提插手法，每穴点留针30 s 出针，6 穴点均必须针刺，计3 min。（2）失眠穴方针刺：取双侧神门、支沟、足三里、三阴交穴。取穴标准依照实验针灸学。干预方法：以毫针（0.25 mm×25 mm）刺入穴位相应的深度，施80～160次/min的高频小幅度捻转手法，每穴留针25～30 s，单次治疗时长4 min。2）正常组与模型组不做任何针刺，给予同针刺组相同时间的搔抓刺激，单次治疗时长7 min。3）非穴组针刺大鼠两肋下缘各两个固定非穴点，其定位于乳正中线外开2.5 mm，肋弓下1 mm，针刺方向与肋弓平行，针尖向外斜刺3 mm；每穴行针90 s，继续抓摸1 min，单次治疗时长7 min。

1.5 组织处理

1.5.1 大鼠海马组织取材方法 大鼠麻醉后，打开胸腔，寻找心脏，自左心室心尖部插入50 mL 针头抵至主动脉，在右心耳下角剪一小洞，使用针管灌注生理盐水200 mL 直到脏器颜色发白发亮，随后加用4%多聚甲醛，注入200 mL，待大鼠全身僵硬，迅速取出大脑，根据大鼠解剖学图谱，取下将海马组织包含在内的冠状断面，每块厚约2 mm，4%多聚甲醛固定液固定。

1.5.2 海马组织处理及切片 取海马组织在4%多聚甲醛溶液后固定过夜。在制片流程中，备用脱水最容易出错。梯度乙醇浸泡脱水，置于二甲苯中透明，再浸蜡，逐次经石蜡Ⅰ（52℃～54℃）、石蜡Ⅱ（56℃～58℃）各2 h 后，依次序常规包埋、切片，切片厚度约5 μm，水浴展片，用防脱载玻片捞片后，自然干燥后放入60℃烤箱烤1.5～2 h。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠海马5-HT1A、5-HT2A受体表达 烤片和脱蜡时，将玻片置于65℃恒温烘箱中烤片1 h；先后置于二甲苯I、Ⅱ中浸泡15 min；切片入梯度乙醇（浓度依次为100%酒精I、100%酒精Ⅱ、95%酒精、85%酒精、75%酒精）分别浸泡5 min，自来水冲洗10 min 后完成水化；采用0.01M 柠檬酸钠缓冲溶液中高压（125℃·103kPa）抗原修复后，自然冷却后，PBS 溶液洗涤3 min×3 次；于3%H2O2中，湿盒避光孵育10 min，通过阻断以消除活性；使用10%山羊血清封闭；选择1∶50比例滴加一抗，4℃孵育过夜，PBS溶液冲洗3 min×3次；将切片从4℃冰箱中取出，室温复温，PBS 溶液冲洗5 min×3 次，滴加maxvision 二抗，湿盒孵育1 h；经二氨基联苯胺法病理染色（DAB），苏木素复染细胞核3 min后，样本经梯度酒精分别浸泡5 min 完成脱水；再将玻片置于二甲苯中透明3 min×2 次，中性树胶封片。显微镜下100、200 倍视野下拍照观察，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.6.2 大鼠海马5-HT1A、5-HT2A平均光密度 对组织切片进行图像采集，阳性细胞表达为棕黄色。每张切片海马CA3区200倍视野下随机选取拍照，拍照要求为背景光一致、组织充满观察视野；采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统选相同棕黄色为阳性表达标准，得出每张图像阳性的累积光密度值（IOD）和视野面积（AREA），统计出平均光密度值（AO 值），AO=IOD/AREA，数值越高提示阳性表达越强。

1.7 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件处理数据。计量数据用±s来表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较，若方差齐时采用（LSD）法，若方差不齐则采用（Dunnett′s T3）法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠海马5-HT1AR 及5-HT2AR 表达5-HT1AR经DAB 染色法显示：正常组大鼠海马区5-HT1AR 棕黄色颗粒排列整齐，神经元较为饱满，形状规则，颜色较深，无明显病理改变。模型组大鼠5-HT1AR阳性表达数目减少，呈散在、疏松排列，部分神经元结构不清、正常形态消失。与模型组比较，针刺组5-HT1AR 阳性表达颗粒分布集中且较规则，病理损伤减轻，颜色加深，阳性数目明显增加。非穴组阳性5-HT1AR 颗粒数略多于模型组，排列有一定形状，集中表达区域较少。见图1。

5-HT2AR 经DAB 染色法显示：正常组5-HT2AR 蓝色颗粒数分布集中，排列规则，棕色细胞偶见散在，几乎无病理改变；模型组5-HT2AR 阳性颗粒数目明显增加，阳性表达区域集中，呈一定形状排列；与模型组比较，针刺组5-HT2AR 棕色表达数明显较少，阳性表达区域颜色较浅，条带状规则排列，组织病理损伤基本缓解；非穴组5-HT2AR 阳性表达区域略少于模型组，排列无序，部分细胞结构遭到破坏。见图2。

2.2 大鼠海马5-HT1AR、5-HT2AR平均光密度值模型组大鼠海马5-HT1AR平均光密度值显著低于正常组（P＜0.01），海马5-HT2AR显著高于正常组（P＜0.01），而与非穴组比，差异无统计学意义；针刺组5-HT1AR 平均光密度值显著高于模型组（P＜0.01），5-HT2AR平均光密度值显著低于模型组（P＜0.01），而与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠海马5-HT1AR及5-HT2AR平均光密度值比较（xˉ±s）

3 讨论

长期失眠易导致焦虑不安，加重抑郁乃至恐惧心理，严重影响患者的身心健康[3-6］。失眠病机，多在水火失衡，在阴阳失交，在营卫不和。人之精气盛衰，可从脐部及腹部血气运行观察，脐周血脉的运行直接关系全身的气血变化，针刺脐周影响全身脏腑气血。壮医针刺调气之要，在于通畅龙路、火路、水道、气道、谷道[7-8］。脐内环穴在脐旁开0.5 寸，环线上皆是穴位。其为督脉所过、任脉所荣及冲脉所联属，能调节先天精气与后天水谷精微。脐在人体三部划分中属于人部，是全身脏腑气血、信息交汇处，借助行气手法、针刺补泻，能调五脏之气、补养五脏之神[9］。故有培元固本之效，除用治失眠外，也常用治全身其他疾病。

失眠穴方是罗本华教授临证多年治疗失眠的验方，以神门、支沟、足三里、三阴交为主穴[10］，以沟通阴阳、泻火补水。脐内环结合失眠穴方之所以叠加效应明显，是因为其有效地发挥了脐内环针在腹部联络脏腑经络的作用，又加强了失眠穴中经穴的肢端及远治作用[11］，全面调节了失眠症的脏腑经络、使水火阴阳趋于平衡。

5-HT 及其受体参与睡眠-觉醒机制的调节过程，觉醒时兴奋性最高，被称作大脑的“致眠因子”，通过降低神经细胞外5-HT 浓度可加速睡眠[12］。因此PCPA 失眠模型在探究失眠症机制研究中最被认可[13］。

本实验结果显示：腹腔注射PCPA 能造成大鼠昼夜节律消失，模型组海马5-HT1AR 阳性表达数量下降，分散在视野内，排列疏松，部分神经元结构不清；5-HT2A受体棕黄色阳性数目明显增加，阳性区域集中表达在视野中部，个别阳性颗粒排列较杂乱。因此得知模型组大鼠海马中5-HT1AR 表达下降，而5-HT2AR 表达上升，表明5-HT 受体亚型信号失常可能是PCPA 失眠的致病机制。而失眠穴方合脐内环针刺明显增加失眠大鼠5-HT1AR 海马区域表达，阳性表达数目明显增加，集中表达区域颜色加深，减少了PCPA 失眠大鼠海马5-HT2A受体表达，阳性表达区域颜色变淡，棕色颗粒数减少较多。说明针法在对兴奋与抑制的动态平衡中对失眠大鼠起到了良性调节作用，提示针刺脐内环穴合失眠穴方可调节中枢5-HT 受体及蛋白表达，这可能是其治疗失眠症、调节睡眠-觉醒周期的理论来源之一。

综上所述，阴阳失调、水火失济是失眠总病机。脐内环学合失眠方正是基于该基本病机，而本实验结果从5-HT1AR、5-HT2AR 的调节作用正好提供阴阳平衡调节实验证据。本实验进一步支持其为失眠症治疗的优选方法。