基于网络药理学探讨气血双补方抗慢性心力衰竭的作用机制*

林 鑫，刘 阳，陈林伟，薛一涛△

1 山东中医药大学附属医院,山东 济南 250014；2 南京中医药大学泰州附属医院

气血双补方是著名中医学家孟景春教授的临床经验方[1-5］，该方由人参、炙黄芪、酒当归、酒炒白芍、陈皮、玉竹、酒黄精、制首乌、枸杞子等9 味中药组成，具有补益气血、通阳散结、活血通络、复脉固脱等功效，主要用于治疗慢性心力衰竭疾病[6］。但是对气血双补方的研究仍然存在以下问题：气血双补方抗慢性心力衰竭作用的物质基础及其作用机理尚未阐明，预测气血双补方的相关作用机制依然十分困难。而组学结合网络药理学的研究方法为解决这一难题提供了新的研究思路[7-9］。因此，本研究采用网络药理学的研究思路对气血双补方抗慢性心力衰竭的作用机制进行研究，构建“单味药-活性成分-作用靶点”网络，为深入探讨其作用机制和药效物质基础提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源本研究采用中药系统药理学分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），以人参、黄芪、当归、白芍、陈皮、玉竹、黄精、何首乌、枸杞子为关键词，搜索气血双补方中9味中药的全部化学成分。

1.2 活性化合物筛选本研究以化合物口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 作为活性化合物的筛选条件，筛选出TCMSP中具有较高活性的化合物。

1.3 化合物-靶点网络的构建通过TCMSP 平台寻找与候选化合物相关的潜在靶点，将候选化合物与其潜在的靶点蛋白上传至CytoSpace 3.7.0软件（http：//www.cytoscape.org）生成体现药物-靶点相互作用的网络图，以探讨气血双补方的药理学作用机制。

1.4 疾病靶点的确定搜索TTD 数据库（https：//db.idrblab.org/ttd/）、STRING 数 据库（https：//string-db.org/）以及UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/），共搜索到与慢性心力衰竭相关的靶点302个。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建为了说明靶点蛋白在系统水平上的作用，利用CytoSpace 3.7.0软件中的Bisogenet插件，分别构建成分靶点PPI和疾病靶点PPI，对二者进行拓扑分析并筛选核心靶点。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析本研究利用CytoSpace 3.7.0软件对PPI网络中筛选出的核心靶点蛋白进行GO功能富集分析。

1.7 基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析利用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对PPI网络中的蛋白进行KEGG通路富集分析，说明中药化合物的靶点蛋白在信号通路中的作用，得到气血双补方抗慢性心力衰竭中的主要作用通路，并通过Omicshare软件（http：//www.omicshare.com/）对富集分析结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选通过TCMSP 共收集到气血双补方中化合物共850个，其中来自人参190个，黄芪87个，当归125个，白芍85个，陈皮63个，玉竹62 个，黄精38 个，何首乌12 个，来自枸杞子188 个。以OB≥30%和DL≥0.18 为筛选条件，化合物分子中有128 个符合条件，经去除重复值得到107个化合物，将其作为候选化合物。

2.2 气血双补方化合物-靶点相互作用网络利用CytoSpace 3.7.0 软件将107 个化合物与靶点构建化合物-靶点网络，化合物-靶点网络总共包括284 个节点（104 个化合物节点和177 个靶点节点），1532 条边。107 个化合物中有3 个化合物在数据库中未找到相关靶点，未参与网络构建。在网络中，一个节点的度（Degree）表示网络中和节点相连接的路线条数。在该网络中，每个化合物的平均靶点数目为14.7个，每个靶点平均与8.66个化合物相互作用。在化合物方面，有32 个化合物的作用靶点≥20个，其中靶点≥35个的化合物有9 个。度排名前三的是Mol000098（quercetin）、Mol000422（kaempferol）、Mol000378（7-O-methylisomucronulatol）。在177个潜在靶点中，有114个靶点与3 个以上化合物连接，说明大多数蛋白质都与其他蛋白享有共同的配体。这体现了气血双补方多成分与多靶点之间共同作用的机制，符合中药复方的特点。见图1。

2.3 PPI 网络的构建与分析利用CytoSpace 3.7.0 软件中的Bisogenet 插件，分别构建化合物潜在靶点PPI（727个节点13328条边）和慢性心力衰竭靶点PPI（644个节点10053条边）。将这两个PPI 网络相交得到一个由495 个节点6118 条边组成的网络图。利用Bisogenet 插件对网络中所有点的拓扑参数（通过度、介度中心度和接近中心度）进行分析，选择靶点中每个靶点的度拓扑参数值大于中位数作为筛选核心靶点的条件，得到109 个节点，1385 条边组成的气血双补方与慢性心力衰竭靶点网络图。见图2。

2.4 GO功能富集分析利用DAVID平台对气血双补方PPI网络中涉及的109个核心靶点进行GO功能富集分析。根据发现错误率（false discovery rate，FDR）＜0.05，进一步确认了256 个GO 条目，其中生物过程相关的条目181 个，主要涉及血小板活化、RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录负调节、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录起始等方面；分子功能相关的条目49 个，主要涉及蛋白质结合、转录因子结合、转录因子活性、酶结合等方面；细胞组成相关的条目26个，主要涉及蛋白质复合物、细胞质、大分子复合物等方面。FDR前20个核心靶点见附表1。

2.5 KEGG 通路富集分析利用DAVID 数据库对筛选出的核心靶点蛋白进行KEGG 通路富集分析，对气血双补方PPI 网络中涉及的109 个蛋白子信号通路中的作用进行了富集分析，分析了55.3%，得到了105 条通路。以P＜0.01，FDR＜0.05 进行筛选，其中前20条通路包括癌症中的微小RNA、甲状腺激素信号通路、乙型肝炎通路、南美锥虫病、癌症的途径、非小细胞肺癌通路、丙型肝炎通路、FOXO 信号通路、胆碱能突触、甲状腺癌通路、催乳素信号通路、MAPK 信号通路、趋化因子信号通路、雌激素信号通路、急性髓性白血病通路、长期抑郁症通路、结直肠癌通路、前列腺癌通路、B 细胞受体信号通路、HIF-1信号通路。研究表明，气血双补方的有效成分可能通过作用于这些信号通路来起到调控心力衰竭，从而治疗疾病的目的，运用omicShare（http：//www.omicshare.com/tools/）对富集结果进行可视化处理，见图3。

别类molecular function cellular component molecular function molecular function molecular function biological process biological process cellular component biological process molecular function molecular function biological process cellular component biological process biological process biological process molecular function molecular function molecular function molecular function率误错现发3.61e-21 6.36e-17 2.76e-15 5.02e-14 7.09e-14 1.32e-13 1.54e-13 2.64e-13 6.57e-13 6.64e-13 9.68e-13 9.90e-13 1.49e-12 3.71e-12 3.82e-12 9.27e-12 1.14e-11 1.14e-11 2.01e-11 2.96e-11量数因8059252738303361252520665739363232142513基目GO条的中络1 PPI网表附称名protein binding nucleoplasm transcription factor binding transcription factor activity，transcription factor binding enzyme binding transcription from rna polymerase ii promoter positive regulation of transcription from rna polymerase ii promoter nuclear part cellular response to hormone stimulus transcription cofactor activity transcription coactivator activity signal transduction nuclear lumen positive regulation of gene expression positive regulation of transcription，dna-templated negative regulation of transcription，dna-templated receptor binding hormone receptor binding transcription regulatory region dna binding nuclear hormone receptor binding号体本因基go.0005515 go.0005654 go.0008134 go.0000989 go.0019899 go.0006366 go.0045944 go.0044428 go.0032870 go.0003712 go.0003713 go.0007165 go.0031981 go.0010628 go.0045893 go.0045892 go.0005102 go.0051427 go.0044212 go.0035257

3 讨论

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点（specific signal nodes，SSNS）进行多靶点药物分子设计的新学科。将网络药理学与传统中医药有机结合，其整体性、系统性、动态性的特点与中医整体观念、辨证论治的理论相一致。本研究系统分析了气血双补方9 味中药的有效成分，构建化合物-靶点网络，分析化合物与靶点的相互作用关系。其中化合物-靶点网络中的关键成分是槲皮素、山奈酚、7-O-methylisomucronulatol 等。槲皮素是黄芪、枸杞子的有效成分，山奈酚是白芍的有效成分，7-0-methylisomucronulatol 是黄芪的有效成分。在化合物-靶点网络中polr2a 有着最多的相互作用配体，CTCF 次之，RAB21 再次之。对气血双补方的靶点进行PPI 映射并构建网络，对网络分析后发现了多个与多种复杂疾病紧密相关的关键靶点，如ADRA1D、ADRB1、SLC6A2、XDH、ADRA2C、CHRM2、PPARA、MMP3 等。为了说明作用靶点在基因功能和信号通路中的作用，本研究进行了GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，研究发现气血双补方具有调节蛋白质复合物、RNA 调控、酶结合、转录因子结合、受体结合、基因表达的正调节、细胞死亡调节等方面的功能。大多数基因富集到与癌症有直接关系的通路上，包括胰腺癌通路、肾细胞癌通路、小细胞肺癌通路、甲状腺癌通路、癌症通路等；另一部分负责调控信号通路，包括PI3k-Akt信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路、cGMP-PKG信号通路、ErbB 信号通路、PPAR 信号通路、Fc-RI 信号通路等，另外根据分析结果推测气血双补方中的活性成分如何参与癌症直接相关的通路。本研究通过借助网络药理学手段，预测了气血双补方抗慢性心力衰竭的主要作用机制，为其活性成分研究和实验研究提供了科学的理论依据。