屏风四妙汤治疗复发性外阴阴道假丝酵母菌病小鼠模型疗效及机制研究*

宋桂红，邢冬杰，刘陶然

山东中医药高等专科学校，山东 烟台 264199

外阴阴道白色念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是常见的妇科疾病，虽然该病病原体明确，治疗效果明显[1-2］，但仍有5%的复发率[3-5］。由于外阴瘙痒严重影响了RVVC 患者的工作、生活质量及身心健康[6］，如何提高RVVC 治愈率、减少复发率是目前RVVC 的研究重点。中医认为RVVC 病机为湿热内蕴、下注阴中，正气不足，湿性黏滞、热与湿合、胶着难除是RVVC 病情缠绵难愈的重要原因[7］。玉屏风散与四妙丸均为中医传统名方。玉屏风散补气固表，具有调节人体免疫力的功效[8］；四妙丸具有补肾健脾，清热除湿的作用[9］。二方相合组成的屏风四妙汤，具有扶正祛邪、标本兼治的功用，对RVVC 的复发有着良好的预防与治疗作用。本研究将屏风四妙汤用于不同免疫状态小鼠，以探究其对RVVC的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择ICR雌性小鼠120只，8～10周龄，体质量23～27 g，购自武汉华联科有限公司，实验动物许可证号：SYXK（鄂）2018-0104，动物实验遵循3-R 原则。饲养条件：饲养房温度控制在25℃，空气湿度维持在40%～60%，采取人工光照，昼夜各12 h。

1.2 药物及试剂ATCC10231白色念珠菌标准株（上海复祥生物科技有限公司，批号：201903041）；防风、黄芪、白术、黄柏、苍术、牛膝和薏苡仁等中药均由山东中医药高等专科学校附属医院中药房提供；辣根过氧化酶标记抗体（上海迪申生物技术有限公司，批号：191013）；沙堡葡萄糖琼脂培养基（上海丽臣生物科技有限公司，批号：1086835）；CD11c+抗体（艾博抗有限公司，货号：EP1347Y；批号：ab52632）；EliVision plus 试剂盒（中国福州迈新生物科技有限公司，货号：kit-9902，批号：191124）；DAB Kit（中国福州迈新生物科技有限公司，货号：DAB-1031，批号：191014）；苏木素染色液（中国南京建成公司，批号：200526）；柠檬酸钠缓冲液（中国福州迈新生物科技有限公司，批号：190811）；苏木素-伊红染液试剂盒（中国福州迈新生物科技有限公司，批号：190919）。

1.3 实验仪器101AS-3型干燥箱（日本Olympus公司），BCD-258A/C 型冰箱（盛世元和公司）；BX41型生物倒置显微镜（日本Olympus 公司）；E200 型天平（德国赛多利斯）；耐高温塑料染色架（中国福州迈新，货号：RAK-2001）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 将120只ICR小鼠适应性喂养1 周，采用随机数字表法分为A、B、C 组，每组16只；D、E、F组，对照组，每组18只。

1.4.2 模型制备 白色念珠菌采用阴道内接种：接种时取20 μL 真菌悬液（即白色念珠菌孢子接种量为5×104），在接种日注入所有小鼠阴道内，接种后倒置5 min 防止菌液溢出。1）A、B 组于接种白色念珠菌前10 天开始每只小鼠隔日皮下注射1 mg/mL苯甲酸雌二醇油剂0.1 mL，构建为雌激素化接种白色念珠菌组。2）C、D 组均于接种白色念珠菌前1 天、接种日、接种后1 天给予地塞米松（成都天台山制药有限公司，批号：20191014，规格：0.5 mL/支）腹腔注射0.15 mL，构建免疫抑制接种白色念珠菌组。3）E、F 组隔日皮下注射植物油0.1 mL，构建为正常免疫组。4）A、C、E各组小鼠接种白色念珠菌前10 天开始灌服屏风四妙汤煎剂（10 g生药/kg体质量），为中药干预组。5）B、D、F各组小鼠灌服等体积生理盐水。

1.4.3 试药制备 将防风、黄芪、白术各30 g，黄柏10 g，苍术、牛膝、薏苡仁各15 g 放入不锈钢锅中，加纯净自来水700 mL，浸泡30 min，煎取药液300 mL；二煎加开水400 mL，煎取药液200 mL。合并药液，浓缩为150 mL、过滤，滤液加蒸馏水调制药物浓度0.125 mg/mL，4～8℃冰箱中保存备用。

1.4.4 药物干预 除对照组外各组小鼠阴道接种白色念珠菌。接种菌量5×104；A 组雌激素+中药处理10 天；B 组雌激素处理10 天；C 组地塞米松3 次+中药处理10 天；D 组地塞米松处理3 次；E 组植物油+中药处理10 天；F 组植物油处理10 天；其中A、C、E各组小鼠接种白色念珠菌前10天开始灌服屏风四妙汤煎剂（10 g 生药/kg 体质量）；B、D、F各组小鼠灌服等体积生理盐水。

1.5 观察指标

1.5.1 IHC法检测小鼠阴道内CD11C+水平[10］治疗结束后，以断颈法处死小鼠，摘取其阴道组织，用剪刀剪碎后，经过石蜡切片、抗原修复、灭活酶、封闭、加入抗体CD11C+抗体稀释倍数（1∶500），加入增强剂，使用二氨基联苯胺（diamino benzidine，DAB）溶液显色、苏木素染液复染、脱水封片在400 倍的光学显微镜下观察，取3个表达区域拍照保存。

1.5.2 苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）观察小鼠病理情况[11］摘取小鼠阴道组织，置于4%多聚甲醛固定，然后常规石蜡包埋，HE 染色，根据阴道黏膜组织炎性浸润、充血、水肿情况进行评分，每种病理损伤以0～4 分评估，得分越高表示组织病理损伤越严重。

1.5.3 碘酸雪夫染色（periodic acid-schiff stain，PAS）观察小鼠病理情况[12］摘取小鼠阴道组织，常规石蜡包埋、切片、脱蜡、复水，蒸馏水清洗10 min，Schiff 氏液染色10 min，流水冲洗5 min，苏木素染色3 min，再次脱水、透明，封片在400 倍的光学显微镜下观察，取3个表达区域拍照保存。

1.6 统计学方法采用SPSS 23.0 软件进行数据分析，计量资料采用xˉ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD11c+免疫组化图由免疫组化图片可以看出，对照组大面积被染成棕黄色，阳性细胞较多；C组阳性细胞数量最少，其次为A、B、D、F、E组。见图1。

2.2 CD11c+值检测各组CD11c+表达可以发现，与对照组光密度值比较，A、B、D、C、F、E 组光密度值下降（P＜0.05），其中C组最显著。见图2。

2.3 病理损伤评分与对照相比，A、B、C、D、E、F组小鼠病理评分总分显著升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠病理损伤评分比较（±s） 分

表1 各组小鼠病理损伤评分比较（±s） 分

注：*表示与对照组比较，P＜0.05

组别对照组A组B组C组D组E组F组黏膜上皮细胞鼠数18 16 16 16 18 18 18糜烂0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00溃疡0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00炎性浸润0.00±0.00 0.64±0.48 0.83±0.95 0.38±0.48 1.00±1.73 1.67±1.53 1.00±1.00黏膜下组织充血0.20±0.15 0.30±0.00 0.37±0.25 0.63±0.25 0.50±0.50 0.67±0.57 0.67±0.58炎性浸润0.15±0.18 0.25±0.00 0.38±0.25 0.38±0.48 0.50±0.50 0.50±0.50 0.67±0.58水肿0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00总分0.38±0.16 1.10±0.26*1.75±0.96*1.38±0.63*2.00±2.65*2.00±2.65*2.33±2.08*

2.4 小鼠HE 染色和PAS 染色图经HE 染色和PAS 染色图显示，对照组小鼠阴道黏膜被覆扁平上皮、表面无明显角化、无溃疡、无糜烂，黏膜下组织无明显充血、炎性浸润和水肿情况。A 组阴道黏膜上皮角化程度、炎细胞浸润程度减轻；B 组阴道黏膜上皮角化、无溃疡糜烂、轻微炎细胞浸润；C组阴道黏膜上皮部分有不均匀皮角化、无糜烂溃疡、轻度炎细胞浸润，黏膜下组织轻度充血、炎细胞浸润；D 组阴道黏膜上皮角化厚薄不一、大量炎性细胞浸润、局部糜烂坏死，黏膜下组织轻度充血、炎性细胞浸润；E 组阴道黏膜被覆复层扁平上皮、部分角质化、炎细胞浸润得到改善，黏膜下组织轻度充血、炎细胞浸润；F 组阴道黏膜被覆复层扁平上皮、角质化、中度炎细胞浸润、局坏死，黏膜下组织轻度充血、炎细胞浸润。见图3。

3 讨论

念珠菌性阴道炎是妇科常见病，虽然抗真菌药物可以有效缓解阴道炎症，但随着使用药物的增加，病菌的耐药性也会变强[13-14］。因此本研究寻求中药治疗念珠菌性阴道炎以降低真菌的耐药性。

CD11c 属于细胞表明的跨膜蛋白，参与免疫应答、炎症反应和细胞增殖、分化生理过程，CD11c+细胞可以通过影响T 淋巴细胞的分化程度影响机体组织免疫反应。本研究检测了CD11c+水平，与对照组比较，A 组小鼠CD11c+含量水平显著降低，黏膜上皮细胞炎性浸润显著增强，黏膜下组织炎性浸润得到了显著的改善，这是由于A 组灌服屏风四妙汤煎剂，所以可以认为灌服屏风四妙汤煎剂可以降低黏膜下组织炎性浸润，但对黏膜上皮细胞无明显改善。与B 组相比，A 组CD11c+显著升高且黏膜上皮细胞和黏膜下组织炎性浸润均显著改善，这是由于服用屏风四妙汤煎剂增强了CD11c+的表达。所有组别中，C 组的CD11c+表达最低，这是由于因为接种了免疫抑制白色念珠菌，使得小鼠阴道中的白色念珠菌减少，同时抑制了阴道内的免疫细胞功能。D组CD11c+水平显著升高，这是由于D 组没有接种免疫抑制白色念珠菌，使得小鼠阴道内的细胞免疫未受到抑制，因此使得CD11c+的表达升高。相比D 组，E 组小鼠CD11c+显著升高，且黏膜上皮细胞中的炎性浸润显著升高，说明灌服屏风四妙汤煎剂可以增强小鼠细胞内的免疫，同时CD11c+DC 数目增多且DC 主要分布在上皮细胞。E组小鼠病理评分与D组无显著差异，但CD11c+水平显著高于D组，这是由于灌服屏风四妙汤煎剂后，小鼠的细胞免疫受到促进，使得其CD11c+水平升高。相比E 组，F 组小鼠病理学评分显著升高，但CD11c+水平降低，这是由于E 组和F组均为正常免疫，但E 组小鼠病理损伤较低，这是由于灌服屏风四妙汤煎剂可以有效缓解小鼠病变程度。汪平等[15］研究表明：四妙汤可以有效缓解小鼠病变程度，与本研究得出的结论相一致。

综上所述，小鼠阴道接种白色念珠菌主要病变为阴道黏膜下充血和炎细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，灌服屏风四妙汤煎剂可以有效缓解白色念珠菌感染小鼠阴道内黏膜充血和炎症细胞浸润。