直肠癌组织中嘌呤能离子通道型受体7表达的意义及其与肿瘤细胞特性的关系

蒋文静，邸泰霖，纪云兆，孔 磊，王子斌，刘大鹏

结直肠癌是常见的消化道肿瘤，发病率和死亡率逐年增加[1]。研究证实[2]，结直肠癌的发生是由多个基因参与、多个步骤的复杂过程，与原癌基因和抑癌基因的失衡有关。在癌症发展阶段，炎症细胞会产生大量的活性氧介质，在邻近的上皮细胞中引起DNA损伤和基因突变，或炎症细胞通过炎性因子的分泌促进了癌前细胞中活性氧介质的大量产生，进而促进细胞的癌变[3]。P2受体是与细胞外核苷酸（例如ATP）结合的一种细胞膜受体[4]。其中，嘌呤能离子通道型受体（P2XR）分为7个亚型，即P2XR1-7，P2XR7是所有P2X嘌呤中最晚被克隆的最新成员，参与肿瘤细胞的生长增殖，甚至在肿瘤侵袭和转移中起作用[5]。经发现，P2X7R在上皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞中表达水平显著升高[6]。为了探讨直肠癌P2X7R表达水平及与肿瘤发生发展、细胞增殖及侵袭能力的关系，本研究选取我院收治的直肠癌病理切除标本并结合体外细胞学实验进行研究。

1 资料与方法

1.1 主要仪器设备 BioTek酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。ChemiDoc MP全方位凝胶成像分析系统仪器；倒置生物显微镜37XF购于上海光学仪器一厂。

1.2 主要试剂及细胞株 选取人结直肠癌细胞株（HCT116）和正常结肠直肠上皮细胞（NCM460），购自上海蓝基生物有限公司。免疫组化染色试剂盒购自北京中山生物制品有限公司。细胞计数试剂盒（CCK）购自全式金生物公司。1640培养基购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.3 病例选取 收集2019年10月—2020年10月在我院就诊的直肠癌患者手术切除标本120例，同时选取癌旁组织作为对照，纳入标准：1）均经病理组织学确诊；2）研究前未行放化疗等抗肿瘤治疗；3）临床资料完整；4）患者及家属知情同意。排除标准：1）合并其他恶性肿瘤；2）合并有免疫系统疾病、血液系统疾病等其他严重疾病。

1.4 资料收集 收集患者术后病理性蜡块和患者的临床资料。收集的内容包括：性别，年龄，住院时间，肿瘤标志物指癌胚抗原（CEA）、癌抗原19-9（CA19-9）水平，术前诊断、手术方法、TNM分期、肿瘤大小、肿瘤分化程度，肿瘤位置、肿瘤浸润深度、是否存在肿瘤淋巴结转移、淋巴结转移的数量以及是否存在远处转移等。

1.5 实验方法

1.5.1 细胞培养 将人结肠直肠癌细胞系（HCT116）和正常结肠直肠上皮细胞（NCM460）在含有10%胎牛血清的RMPI 1640培养基中，在37 ℃和5%CO2环境下培养。

1.5.2 免疫组化染色 将手术切除的标本用10%甲醛固定48 h，石蜡包埋，切片厚度约4 μm，在60 ℃烘烤3 h，常规脱蜡，添加3%H2O2孵育10 min，用PBS洗涤3次，每次3 min，柠檬酸溶液修复，在PBS中洗涤，添加一抗并孵育过夜，PBS中洗涤3次，每次3 min，添加聚合物增强剂，在室温下孵育20 min，每次用PBS洗一抗，添加酶标记的抗小鼠聚合物（二抗），在室温下孵育30 min，PBS洗涤3次，每次3 min，DAB显色，然后用苏木精复染，常规脱水和固定。评分标准：根据病理切片中阳性细胞的百分比和染色强度进行半定量免疫组织化学评分以确定结果。标准为：阳性细胞百分比≤10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。着色强度：无着色0分，浅黄色1分，黄色为2分，黄色为2分，棕褐色为3分。将以上两点的乘积作为总分：≤4分为阴性表达，＞4分为阳性表达。

1.4.3 细胞活力检测 苯甲酰-4-苯甲酰-三硝基苯磺酸（BzATP）是P2X7受体的强大激动剂。CCK法测定细胞活力，方法如下：用无血清培养基将细胞制成细胞悬液，并以5×104/mL的密度接种于96孔板上，每孔100 μL，在细胞培养箱中培养18 h。然后除去上清液，加入100 μL含0.01 mmol/L激动剂和0.1 mmol/L激动剂的完全培养基，并在细胞培养箱中孵育24 h。向每个孔中添加10 μL CCK溶液，并继续在细胞培养箱中孵育4 h。于450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD）值。

1.4.4 侵袭实验 预先预冷实验中使用的移液器吸头和EP管。将基质胶原蛋白溶液在冰上融化并涡旋混合，然后以1∶5的比例提取并混合，与无血清培基制成基质胶工作液。将基质胶工作液均匀地分散在Transwell腔室中滤膜上层的底部，轻轻地将其置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中凝胶化4 h，然后向其中添加1640培养基水合1 h。

在上腔室中加入100 μL 1640培养基，在下腔室中加入600 μL含10%胎牛血清的1640培养基，并在37 ℃下水合1 h，于37 ℃，5%CO2的培养箱中放置24 h。选择生长状态良好的细胞消化和悬浮，并调整密度为1×106/mL，接种在基质胶 Transwell的上腔室中（200 μL/孔），孵育24 h，取出Transwell室，用棉签快速擦拭过滤器上的基质胶，用PBS冲洗3次，并用预冷的95%乙醇固定30 min。常规HE染色，中性树胶封固，在200倍光学显微镜下随机选择滤光片的5个视野进行拍照，计算跨膜细胞的数量。

1.4.5 Western blotting检查 将细胞培养48 h后，收集细胞，加入细胞裂解液，提取总蛋白，并用BCA检测试剂盒检测蛋白浓度。制备10%分离凝胶和5%浓缩凝胶，电泳转移膜，5%脱脂奶粉封闭剂，置于小鼠抗人PWX7R抗体（1∶3000稀释度）或小鼠抗人GAPDH（1∶1000稀释度）中，于90 ℃过夜孵育后，洗涤膜，滴加兔抗小鼠二抗，在室温下孵育1 h，然后洗涤。将洗净的PVDF膜放入ChemiDoc MP全方位凝胶成像分析系统仪器中以扫描膜，然后使用Image Lab软件处理图像以得到最终结果。

2 结果

2.1 直肠癌和癌旁组织P2X7R表达比较 直肠癌P2X7R的阳性表达率明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 直肠癌和癌旁组织P2X7R阳性表达率比较

2.2 P2X7R表达与直肠癌临床病理的关系 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有脉管浸润直肠癌组织P2X7R阳性表达率明显低于Ⅰ～Ⅱ期、无脉管浸润直肠癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同性别、年龄、肿瘤大小、分化程度直肠癌组织P2X7R阳性表达率比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 P2X7R表达与直肠癌临床病理特征的关系

2.3 HCT116与NCM460细胞中PWX7R表达比较 HCT116细胞的PWX7R蛋白相对表达量明显低于NCM460细胞，差异有统计学意义（P＜0.001），见表3、图1。

图1 HCT116与NCM460细胞中PWX7R表达

表3 HCT116与NCM460细胞PWX7R表达量比较

2.4 各组细胞增殖情况比较 0.01 mmol/L激动剂组、0.1 mmol/L激动剂组细胞培养12 h、24 h和48 h时OD值明显低于对照组，0.1 mmol/L激动剂组细胞培养12 h、24 h和48 h时OD值明显低于0.01 mmol/L激动剂组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 各组细胞增殖情况（OD值）比较

2.5 各组细胞侵袭率比较 0.01 mmol/L激动剂组、0.1 mmol/L激动剂组细胞侵袭数低于对照组，0.1 mmol/L激动剂组细胞侵袭数明显低于0.01 mmol/L激动剂组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5、图2。

图2 各组细胞侵袭图

表5 各组细胞侵袭情况比较

2.5 各组细胞蛋白相对表达量比较 0.01 mmol/L激动剂组、0.1 mmol/L激动剂组p-STAT3、PWX7R蛋白相对表达量高于对照组，0.1 mmol/L激动剂组p-STAT3、PWX7R蛋白相对表达量明显低于0.01 mmol/L激动剂组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表6和图 3。

表6 各组细胞p-STAT3、PWX7R蛋白相对表达量比较

图3 各组Western blotting检查图

3 讨论

目前，结直肠癌的病因尚不十分清楚，是多基因相互作用和多个信号通路参与的结果。三磷酸腺苷（ATP）是直接能量供应分子，并且可以在细胞外发挥信号分子和神经传递分子的作用[7]。P2X7R是ATP门控的非选择性阳离子通道，而ATP是P2X7受体的唯一已知内源性激活剂，主要在免疫细胞中表达[8]，目前也有发现它在中枢神经系统和周围神经系统的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中大量表达[9]。P2X7R主要调节细胞增殖和凋亡。有研究表明[10-11]抑制P2X7R可以诱导肿瘤生长，而激活P2X7受体则可以诱导肿瘤细胞死亡。

本研究结果显示，直肠癌P2X7R阳性表达率明显低于癌旁组织，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有脉管浸润直肠癌组织P2X7R阳性表达率明显低于Ⅰ～Ⅱ期、无脉管浸润直肠癌组织，证实了P2X7R的表达在直肠癌组织中显著下调，并且其表达与肿瘤TNM分期和血管侵袭显著相关。P2X7R在直肠癌中发挥抑癌基因的作用。P2X7受体可以通过以下方式抑制肿瘤的发生[10-12]：1）P2X7受体的激活可以直接抑制肿瘤细胞的增殖；2）P2X7受体激活可显著增加肠道炎性因子水平，增强肠道免疫细胞的功能，从而抑制肠道肿瘤的发生。3）大肠癌组织中的Tregs具有很强的免疫抑制功能，可以促进肿瘤细胞的免疫逃逸。并且本研究中结直肠癌细胞PWX7R蛋白相对表达量明显低于正常结直肠上皮细胞，结果与组织中PWX7R蛋白表达情况一致。

本研究中，0.01 mmol/L激动剂组、0.1 mmol/L激动剂组细胞培养12 h、24 h和48 h时OD值明显低于对照组，其中0.1 mmol/L激动剂组细胞培养12 h、24 h和48 h时OD值明显低于0.01 mmol/L激动剂组，提示P2X7R激动剂 BzATP可导致结直肠癌细胞活力显著降低，特别是高浓度的BzATP。该结果表明结直肠癌细胞上可能还有其他未知途径介导BzATP对降低HCT116细胞活力的影响。0.01 mmol/L激动剂组、0.1 mmol/L激动剂组细胞侵袭数低于对照组，其中0.1 mmol/L激动剂组细胞侵袭数明显低于0.01 mmol/L激动剂组。BzATP在高浓度下表现出明显的抑制增殖效应。研究表明[13-15]P2X7R的激活可以直接抑制肿瘤细胞的增殖，而P2X7R的拮抗作用可以显著促进癌细胞株的增殖。

STAT3被激活后可以形成同型二聚体，并从细胞质转运至细胞核并与DNA结合，调控细胞周期、细胞增殖、侵袭和转移过程[16-18]，参与细胞的各种功能。肠上皮细胞STAT3的失活不仅可以影响急性或慢性肠炎中肠细胞的存活和增殖，而且可以减少结直肠癌模型中肠肿瘤的数量[19-20]。本研究结果显示，0.01 mmol/L激动剂组、0.1 mmol/L激动剂组p-STAT3、PWX7R蛋白相对表达量高于对照组，其中0.1 mmol/L激动剂组p-STAT3、PWX7R蛋白相对表达量明显低于0.01 mmol/L激动剂组。1 mmol/L BzATP显著抑制STAT3的磷酸化，表明P2X7受体可能通过抑制STAT3的激活而抑制肿瘤细胞的增殖，并在结直肠癌的进程中起抑制作用。结合本实验在细胞系上的结果，P2X7R的激活可以抑制肠道肿瘤细胞中STAT3的激活，这与P2X7R抑制结直肠癌进展是一致的。下一步研究还需要进一步确定哪些蛋白主要受STAT3的激活和抑制的影响，从而影响结直肠癌细胞的增殖。

综上所述，直肠癌P2X7R表达下调，与肿瘤分期及脉管浸润有关，表明P2X7R可能抑制结直肠癌的进展，其可能的机制之一是P2X7R抑制了肠道肿瘤细胞中STAT3的激活。