miR-7-5p通过靶向抑制成纤维生长因子受体4影响胆囊癌细胞的增殖和迁移

李云超，孙占峰，苏 彬，胡金朋，王振国，王月明

胆囊癌（GBC）是胆道系统恶性肿瘤中最具侵袭性的一种，因其临床特征不明显，缺乏有效的检测和预后指标，诊断时往往已到疾病晚期，即使行GBC根治手术，预后仍不理想[1]。因此，研究GBC的发病机制具有十分重要的临床意义。近年来的研究报告显示，微小RNA（microRNA，miR）表达异常与肿瘤进展有关[2]，miR-197可以促进胆囊癌细胞增殖，抑制细胞凋亡[3]；miR-182促进胆囊癌上皮-间充质转化[4]；miR-204抑制胆囊癌细胞的增殖、侵袭和凋亡[5]。研究表明，成纤维生长因子受体（FGFR）高表达是胆囊癌的敏感的不良预后标志物[6]，miR-7-5p在多种癌症中充当抑制肿瘤因子或抗癌基因[7]，miR-7-5p靶向结合FGFR4的3’-UTR，但其在胆囊癌中的作用尚不清楚[8]。本研究旨在阐明miR-7-5p在胆囊癌中的作用机制，以期为临床相关研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 胆囊癌GBC-SD细胞及正常胆囊细胞购自上海中科院细胞库，miR-7-5p、pmirGLO、FGFR4WT、FGFR4 MUT、miR-7-5p inhibitor、miR-7-5p mimics和mimics-NC由上海生工生物工程有限公司合成，FGFR4抗体购自美国abcam公司，MTT、Trizol及去RNA酶处理的物品购自美国sigma公司，RT-qPCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，Transwell小室、细胞培养板及计数板购自美国康宁公司，DMEM培养基、胎牛血清、胰酶等细胞培养试剂购自美国Gibco公司，BCA蛋白试剂盒购自上海碧云天科技公司。其他试剂均由当地试剂商提供。

1.2 RT-qPCR检测 使用Trizol提取总RNA，利用反转录试剂盒将引物（表1）得到cDNA链。以β-actin为内参，定量PCR检测miR-7-5p和FGFR4的表达水平。实验重复3次，数据采用2-ΔΔCt法进行分析。

表1 PCR引物序列及扩增产物大小

1.3 细胞培养及转染 转染miR-7-5p、对照（NC）和抑制剂（Inhibitor）进入GBC-SD细胞。根据细胞的密度进行换液或者传代。每次传代时，加入2.5 μg/mL嘌呤霉素继续筛选稳定的细胞株。72 h后将细胞一部分用于后续的RT-qPCR、Transwell、Western blotting等实验，另一部分冻存保种。

1.4 双荧光素酶检测 生物信息学网站TargetScan用于预测FGFR4的目标mRNA。通过Creative Biogene克隆FGFR4 mRNA 3’-UTR靶序列。将FGFR4UTR的野生型（WT）/突变型（MUT）、miR-7-5p序列插入pmirGLO质粒中，以建立重组荧光素酶报告质粒（FGFR4 WT/FGFR4 MUT和miR-7-5p mimics）。分别将pmirGLO、FGFR4 WT、FGFR4 MUT、miR-7-5p mimics和mimics-NC分别转染至293T细胞。孵育48 h后，使用双重荧光素酶®报告基因检测法检测了293T细胞的萤火虫和海藻荧光素酶活性。

1.5 MTT检测 采用MTT法检测GBC-SD细胞活性，取对数生长期的各组细胞计数（2×105个/mL）后接种于96孔板，每孔50 μL，每组设置3个复孔。培养12 h后，每孔加MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，加150 μL DMSO终止反应，选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值，记录结果，连测48 h，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.6 Transwell实验 取重悬各组细胞（1×104/mL）200 μL加入Transwell小室中，置于实验孔中培养24 h；取出Transwell小室，PBS清洗后，利用棉签擦去小室薄膜上层细胞后，结晶紫染色薄膜下层细胞后，置于显微镜下计数拍照。

1.7 Western blotting 取各组细胞提取的蛋白质，BCA试剂盒测量样品的总蛋白质量，电泳分离后转膜。将膜在4 ℃下用一抗孵育过夜：FGFR4抗体（1:1 000）、兔单抗 β-actin抗体（1:1 000）。然后将膜与二抗孵育2 h，TBST冲洗4次，用ECL plus检测信号，用Image J软件定量分析。

1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0软件处理实验数据，Graphpad prism 5软件绘图，数据用均数±标准差（）表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析；相关性分析采用Person相关；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GBC-SD细胞中miR-7-5p、FGFR4表达情况 与正常胆囊细胞相比，GBC-SD细胞中miR-7-5p mRNA表达水平明显降低，FGFR4 mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01，图1A、1B）；FGFR4蛋白表达量也高于正常胆囊细胞（0.15±0.07 vs.0.73±0.09；P＜0.01，图1C）；且GBC-SD细胞中miR-7-5p mRNA表达水平与FGFR4 mRNA表达水平呈负相关（r=-0.036，P＜0.05，图1D）。

图1 GBC-SD细胞与正常胆囊细胞中miR-7-5p及FGFR4的mRNA和蛋白表达水平比较

2.2 miR-7-5p靶向作用FGFR4 经过生物信息学网站TargetScan预测，miR-7-5p作为保守序列作用于人源FGFR4基因，作用位点见图2A。双重荧光素酶基因检测系统结果显示，与FGFR4 WT+mimics-NC组相比，FGFR4+miR-7-5p模拟组的荧光素酶活性明显降低（P＜0.05），而且miR-7-5p的过表达对用pmirGLO MUT FGFR4 3’UTR转染的细胞的萤光素酶活性无影响（图2B）。

图2 miR-7-5p靶向作用FGFR4

2.3 miR-7-5p靶向抑制FGFR4 表达 抑制miR-7-5p后，与对照组相比，GBC-SD细胞miR-7-5p mRNA表达水平明显下降，FGFR4 mRNA及蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05，图3A、3B）；过表达miR-7-5p后，miR-7-5p mRNA表达水平明显高于对照组和miR-7-5p抑制组，FGFR4 mRNA及蛋白表达水平明显低于对照组和miR-7-5p抑制组，差异有统计学意义（P＜0.05，图3C、3D）。

图3 miR-7-5p靶向抑制FGFR4表达

2.4 miR-7-5p过表达促进GBC-SD细胞增殖和侵袭 MTT实验结果显示，实验48 h，miR-7-5p抑制组细胞增殖率明显高于对照组[（2.31±0.09）%vs （2.06±0.06）%]，差异有统计学意义（P＜0.05），miR-7-5p过表达组细胞增殖率（1.87±0.06）%明显低于其他两组（P＜0.05），差异有统计学意义（图4A）。Transwell实验结果显示，miR-7-5p抑制组穿膜细胞数明高于对照组[（94.3±7.5）个vs （55.5±8.2）个]，差异有统计学意义（P＜0.05），miR-7-5p过表达组穿膜细胞数（28.7±2.5）个明显低于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05，图4B）。

图4 MTT和Transwell实验

3 讨论

miRNAs的异常表达与人类恶性肿瘤的发生相关，其中miR-7-5p的上调在多种癌症中表现出癌症抑制作用[7,9-10]。在肝细胞肝癌中，miR-7-5p的上调可以通过靶向细胞分裂相关基因SPC24显著抑制肝癌细胞的恶性行为[11]，miR-7-5p下调表皮生长因子受体（EGFR）表达，灭活PI3K/Akt信号通路，抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和微管形成，减少肿瘤形成和转移[12]，miR-7-5p通过靶向神经肿瘤腹侧抗原2 （NOVA2）抑制非小细胞肺癌的肿瘤转移[13]。本研究发现miR-7-5p在GBC-SD细胞中的表达下调，提示作为抑癌基因的miR-7-5p可能参与了抑制GBC的肿瘤发生。细胞增殖试验和Transwell试验进一步证实miR-7-5p能抑制GBC-SD细胞增殖和侵袭。这些数据共同支持了miR-7-5p在GBC中充当肿瘤抑制miRNA的推断。

FGFR4是成纤维细胞生长因子受体家族成员，被认为是一种癌蛋白。有研究证明miR-491-5p抑制某些癌症的肿瘤生长并可以间接抑制FGFR4，从而削弱上皮间质转化（EMT）诱导的肿瘤迁移[14]。另一项研究表明，过表达的miR-29c-3p会减少KIAA1199（一种细胞迁移诱导蛋白）的分泌，随后抑制EGFR和FGFR4/AKT通路激发的EMT效应[15]。因此，FGFR4已成为抑制癌症发展的潜在目标。以往的研究中FGFR1-3 在许多实验和临床试验中被证实是癌症有希望的靶标。而与FGFR1-3相比，以FGFR4为靶点的小分子抑制剂的开发是近几年才取得突破的。选择性小分子FGFR4抑制剂BLU9931，在具有异常FGFR4 信号的肝细胞癌细胞中表现出显著肿瘤抑制能力[16]。BLU9931在GBC的研究中可以显著抑制FGFR4的表达，抑制GBC细胞的增殖和侵袭[17]。这些研究进一步证明，FGFR4是治疗GBC有希望的靶点，具有十分重要的临床意义。

有研究发现FGFR4是GBC不良预后的敏感生物标志物[6]，miR-7-5p可以直接与FGFR4的3’-UTR结合[8]。为了进一步明确miR-7-5p与FGFR4的关系，本研究通过生物信息学分析证明FGFR4作为miR-7-5p的靶点，并通过双荧光素酶基因检测进行这种相互作用的验证，结果发现FGFR4UTR的野生型可以与miR-7-5p结合，显著降低293T细胞的萤火虫和海藻荧光素酶活性。而在本研究结果中，FGFR4在GBC-SD细胞中异常升高，并与miR-7-5p表达呈负相关。这些结果为miR-7-5p在GBC中靶向调节FGFR4提供了证据。FGFR4的遗传畸变在各种类型的癌症中普遍存在，例如乳腺癌、胰腺癌、肝细胞癌，而这些畸变通常与不良预后有关[18-19]。并且先前的研究结果一致表明，FGFR4畸变导致下游信号通路的失调，例如Wnt/β-catenin[20]、JAK/STAT[21]和PI3K-AKT[22]，从而导致癌细胞增殖和转移潜力增强，引起癌症进展。最近的研究表明，在肝癌进展中miR-7-5p可以通过Wnt、TGF-β和Ras信号通路靶向目的基因；而蛋白质-蛋白质网络（PPI）分析表明，miR-7-5p的靶基因包括PIK3CA、AKT1、MYC、JUN 和SMAD4等[23]。上述研究结果表明，miR-7-5p与FGFR4在癌症的发生发展中存在共同的下游信号通路。在本研究中，抑制miR-7-5p后FGFR4表达增加，GBCSD细胞的增殖侵袭能力增强。过表达miR-7-5p后FGFR4表达下降，GBC-SD细胞的增殖侵袭能力下降。这些结果进一步支持了miR-7-5p通过靶向抑制FGFR4来阻止GBC进展。