益气化瘀方调控PI3K/AKT/mTOR信号通路对糖尿病溃疡大鼠外周神经修复的作用

何斌俊，邢 捷，阙华发

糖尿病溃疡是糖尿病常见的并发症之一。糖尿病溃疡有神经病理性、缺血性和神经-缺血性三种类型。神经病变会使患者对温度和压力的感觉减弱，创伤、溃疡不易被察觉。糖尿病神经病变会使溃疡发生的风险增加15%，溃疡复发的风险是正常人的7倍[1]。据国际糖尿病联合会(IDF)的数据统计显示，截至2019年，全球已有糖尿病患者4.63亿例，其中有（4000～6000）万糖尿病患者患有神经和（或）血管损伤及糖尿病溃疡并发症[2]。P物质是由外周神经释放的神经肽，参与创面愈合并发挥着重要作用。神经生长因子（nerve growth factor,NGF）是一种二聚体蛋白，在神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性表达方面有重要的调控作用。研究发现，益气化瘀方治疗糖尿病溃疡疗效显著，同时，动物实验发现其对糖尿病大鼠神经修复有较好作用[3-4]。本实验旨在探讨益气化瘀方是否能通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路影响NGF、P物质的表达，影响糖尿病溃疡大鼠外周神经的修复。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠共30只，体质量（160±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司提供，实验动物许可证号：SCXK(沪 )2017-0011。

1.2 药物 益气化瘀方由生黄芪30 g，太子参30 g，黄精15 g，丹参30 g，桃仁12 g，地龙12 g组成，将以上中药煎取、浓缩，4 ℃冰箱保存。

1.3 试剂及仪器 链脲佐菌素（streptozocin,STZ）（批号：WXBD1402V），日本Sigma公司；雷帕霉素（货号：S1039），美国Selleck Chemicals公司；舒泰50注射用麻醉剂（批号：BN7NWF），法国维克有限公司；LY294002（货号：040419200521），上海碧云天生物技术有限公司；ECL显色试剂盒（批号：P0018FS），上海碧云天生物技术有限公司；一抗NGF（货号：Ab52918），美国abcam公司；一抗GAPDH（货号：5174），CST公司；HRP标记山羊抗兔IgG抗体（货号：A0208），上海碧云天生物技术有限公司；大鼠P物质ELISA试剂盒（货号：CSBE08358r），CUSABIO 公司；Trizol（货号：15596018），赛默飞公司；反转录试剂盒（货号：RR037A），TAKARA公司；RT-PCR试剂盒（货号：RR820B），TAKARA公司；酶标仪（型号：Synergy H1MF），美国Biotek公司；凝胶成像系统（型号：Chemiscope 6300），上海勤翔科学仪器有限公司；实时荧光定量PCR仪（型号：7500fast），美国ABI公司；肌电图仪（型号：NTS-2000），上海诺诚电气有限公司。

1.4 动物造模 配制pH值为4.32、浓度为0.1 mmol/L的柠檬酸钠缓冲液，溶解STZ配制成1%溶液。以55 mg/kg体质量单次向大鼠腹腔注射1%STZ-柠檬酸钠溶液，72 h后随机血糖大于16.7 mmol/L，为糖尿病造模成功[5]。成模后饲养6周，在舒泰50麻醉下，用肌电图仪测量大鼠尾部感觉神经传导速度，以尾部感觉神经传导速度（SNCV）＜30 m/s作为糖尿病周围神经病变成模标准[6]。糖尿病周围神经病变成模后，所有大鼠以40 mg/kg体质量腹腔注射舒泰50，腰背部备皮，以直径2 cm的模具标记造模区，切除全层皮肤[7]。

1.5 分组与给药 通过SPSS25.0软件产生随机数字，将30只大鼠分成正常组6只、糖尿病组24只，成模后将24只糖尿病大鼠随机分入模型组、益气化瘀方（YQHYF）组、益气化瘀方+PI3K抑制剂（YQHY+LY）组、益气化瘀方+mTOR抑制剂（YQHY+RA）组，每组6只。创面造模后次日给药，YQHYF组、YQHY+LY组、YQHY+RA组中药灌胃2 mL/d。YQHY+LY组在中药灌胃同时按1 mg/kg腹腔注射LY294002 0.2 mL/d，YQHY+RA组在中药灌胃同时按3 mg/kg腹腔注射雷帕霉素0.2 mL/d；正常组、模型组生理盐水灌胃2 mL/d。各组创面每天均用1:5000呋喃西林溶液清洁。

1.6 神经传导速度检测 分别在给药前和给药第21天使用肌电图仪测各组鼠的神经传导速度。

1.7 透射电镜神经形态学观察 给药第21天，麻醉大鼠，迅速取各组大鼠坐骨神经组织，经固定、脱水、包埋固化后，切成超薄切片，醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染后，用透射电镜观察形态。

1.8 ELISA 给药第21天，取各组大鼠创面肉芽组织，匀浆后取上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在450 nm波长处检测创面神经肽P物质的吸光度，计算含量。

1.9 Western blotting 给药第21天，取各组鼠创面肉芽组织50 mg，加入RIPA裂解液500μL，匀浆组织与裂解，取上清液检测样本蛋白浓度。蛋白变性后，经10%SDS-PAGE胶电泳分离，转移至PVDF膜上，在5%脱脂奶粉中封闭40 min，加入一抗（NGF 1:1000，GAPDH 1:2000）4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜后，加入二抗（1:1000）室温孵育40 min，TBST洗膜，滴加ECL发光液，在凝胶成像系统中曝光检测，用Image J软件进行图像灰度分析。

1.10 实时定量PCR 给药第21天，取各组鼠创面肉芽组织，加入Trizol提取总RNA，分光光度计检测RNA浓度，使用反转录、PCR试剂盒合成cDNA，并扩增，以β-actin为内参，反应条件为95 ℃预变性1 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72℃延伸30 s（40个循环）。采用2-△△Ct法计算NGF mRNA表达。引物由上海英俊生物技术有限公司合成，序列如下，NGF正向：5’-AACACTTTGTGGCCTGAACC-3’，反向：5’-AGGCAGAGGAAGACGATGAA-3’；β-actin 正向：5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’，方向：5’-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3’。

2 结果

2.1 神经传导速度 给药前，与正常组比较，模型组、YQHYF组、YQHY+LY组、YQHY+RA组神经传导均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。在给药第21天，与正常组比较，其余各组神经传导速度均降低；与模型组比较，YQHYF组神经传导速度升高；与YQHYF组比较，YQHY+LY组、YQHY+RA组神经传导均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

表1 给药前后各组动物SNCV比较

2.2 坐骨神经形态学 在给药第21天，正常组有髓神经纤维髓鞘、轴索内结构均完整；模型组髓鞘板层结构分离，轴索萎缩；YQHYF组有髓神经纤维髓鞘板层轻度分离；YQHY+LY组、YQHY+RA组有髓神经纤维髓鞘板状分离，轴索内线粒体聚集，微丝微管紊乱，雪旺细胞肿胀。见图1。

图1 各组大鼠坐骨神经形态改变（×6 000）

2.3 创面神经肽P物质的表达 给药第21天，与正常组比较，模型组P物质浓度显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，YQHYF组P物质浓度显著增加；与益气化瘀方组比较，YQHY+LY组、YQHY+RA组P物质浓度均减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 各组给药第21天创面P物质浓度比较

2.4 创面组织NGF蛋白的表达 给药第21天，与正常组比较，模型组NGF蛋白表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，YQHYF组NGF蛋白表达增加；与YQHYF组比较，YQHY+LY组、YQHY+RA组NGF蛋白表达均减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3、表2。

图3 给药第21天各组NGF蛋白表达

2.5 创面组织NGF mRNA的表达 给药第21天，与正常组比较，模型组NGF mRNA相对表达量显著减少（P＜0.01）；与模型组比较，YQHYF组NGF mRNA相对表达量显著增加（P＜0.01）；与YQHYF组比较，YQHY+LY组、YQHY+RA组NGF mRNA相对表达量显著减少（P＜0.01）。见表2。

表2 给药第21天各组NGF蛋白和NGF mRNA表达水平比较

3 讨论

糖尿病性溃疡是一种以外周神经病变和外周动脉病变为基础的慢性难愈合创面[1]。Reiber等[8]研究显示，45%～60%的足部溃疡完全是由外周神经病变引起的。临床和基础研究证实，外周神经病变的发生是以异常的葡萄糖代谢为基础的，高血糖促进多元醇途径、蛋白激酶C途径、糖基化终末产物途径、多聚核糖聚合酶和氨基己糖合成途径激活，通过影响胰岛素信号通路，对线粒体功能、基因表达和氧化应激产生影响[9]，从而加重外周神经病变。同时，高血糖可引起的周围神经组织中雪旺细胞（schwann cells,SC）和血管内皮的周细胞代谢紊乱，使血神经屏障、雪旺细胞功能障碍引起周围神经稳态破坏，诱导产生脱髓鞘等损伤，由于髓鞘被破坏，轴突稳态和再生受损导致周围神经病变的进展[10]。

创面愈合过程主要由止血、局部炎症反应、细胞增殖分化和组织重建4个重叠的阶段组成[11]，且是一个复杂的病理生理学过程。它涉及不同类型的细胞（如免疫细胞、角质细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞）、细胞因子（成纤维细胞生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、NGF等）和细胞外基质[12]。创面愈合过程中任何因子的缺失都能导致创面愈合障碍。神经生长因子是发现最早的神经营养因子，是中枢和外周神经系统发育和维持的基本神经营养因素[13-14]。SC是外周神经特有的胶质细胞，是外周神经再生微环境的重要成分，而NGF的重要来源是神经损伤后能分裂增殖的SC[15]。NGF不仅是神经维持正常功能必需的物质，在创面愈合过程也有重要作用[16]，创面肉芽组织所表达的NGF活性，可以促进创面的愈合。在生理过程中，NGF可以通过不同类型的细胞在皮肤组织中持续表达来维持皮肤稳态[17]。NGF可以调控神经肽P物质的合成，通过参与编码神经肽P物质的前体分子来调节其合成[18]。神经肽P物质广泛分布于神经与血管内皮细胞中，其可促进单核细胞趋化蛋白-1、皮肤特异性干细胞、成纤维细胞、表皮生长因子等多种生长因子表达。同时，在糖尿病足溃疡中P物质等介质影响创面愈合的整个过程。溃疡周围皮肤神经纤维减少，P物质含量下降，引起患者伤口延迟愈合[19]。PI3K/Akt/mTOR信号通路可参与细胞生长、增殖、分化调节，由PI3激酶产生的磷酸化P3对神经元的存活和发育有重要作用，同时PI3激酶激活许多靶点，促进轴突生长和神经元分化[20]。NGF对创面再上皮化愈合作用机制与激活PI3K/Akt通路加速真皮成纤维细胞迁移有关[21]。

益气化瘀方全方由生黄芪30 g、太子参30 g、黄精15 g、丹参30 g、桃仁12 g、地龙12 g组成。前期研究证实益气化瘀法可促进糖尿病溃疡创面血管和神经再生[4,22]。本研究观察坐骨神经形态学，检测神经传导速度，创面组织P物质、NGF的表达量。结果显示，糖尿病溃疡大鼠坐骨神经结构破坏，神经传导速度下降，创面组织中的P物质含量下降，NGF蛋白和NGF mRNA表达水平下调；而益气化瘀方可使坐骨神经破坏减轻，神经传导速度升高，创面组织中P物质含量增加，NGF蛋白和NGF mRNA表达水平上调；益气化瘀方+PI3K抑制剂组、益气化瘀方+mTOR抑制剂组的坐骨神经结构破坏，神经传导速度下降，创面组织中的P物质含量下降，NGF蛋白和NGF mRNA表达水平下调。结果表明益气化瘀方可能通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路增加外周神经P物质含量，提高NGF表达，改善糖尿病周围神经病变，提高神经传导速度，促进糖尿病溃疡大鼠创面外周神经修复，后续将进一步深入研究相关机制。