视网膜母细胞瘤组织中miR-142的表达及对细胞增殖和侵袭力的影响

罗 钢，蔡丽英，呙 明（.鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院，湖北黄石 435000；.荆州市中心医院，湖北荆州 434000）

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）作为儿童期常见的眼部恶性肿瘤，起源于胚胎型光感受器前体细胞，超过60%的患儿发病年龄在3岁以内[1]，该肿瘤恶性程度高，致残、致盲率高，易发生颅内及远处转移[2]，对患儿生命健康构成了严重威胁。目前，对该病的治疗主要是手术摘除、放化疗、冷冻、光凝等，但这些治疗方法副作用大，对患儿身体伤害大，总体预后不佳[3]，因此，积极寻找有效的治疗方案以保留患儿眼球和视力、提高患儿生存率已成为临床研究热点和难点。随着分子靶向治疗技术的发展和应用，为RB诊疗提供了新的前景[4]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作为一类长度在19～22个核苷酸的高度保守的内源性RNA，在机体组织、器官中广泛存在，在多项生理病理过程中发挥重要作用[5]，近年来研究发现[6]，其可通过调控靶基因表达而参与了多种恶性肿瘤发生、进展过程。miR-142作为一种miRNA，在肿瘤组织中出现异常表达[7]，参与了肿瘤细胞异常增殖，且可加速细胞侵袭及转移[8]。本研究检测了RB组织中miR-142表达，比较了不同临床指标间差异性，并通过对人RB细胞株Y79转染miR-142模拟物，观察其对细胞增殖和侵袭力的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2013年6月～2019年6月在黄石市中心医院接受眼球摘除手术治疗的RB患儿，纳入标准：①单侧眼；②术前未行放化疗；③术后病理确诊。排除心肝肾等重要脏器严重功能障碍者、急慢性感染者，以及神经系统疾患者。共入选患儿79例（79眼），其中，男性48例，女性31例，年龄4个月～10（3.86±0.92）岁，眼侧：左侧42例，右侧37例；分化程度：未分化型36例，分化型43例；出现神经浸润41例。收集RB组织和癌旁正常组织（距离癌组织边缘1～2cm范围内），-80℃液氮保存。本研究由医院伦理委员会批准，患儿家属均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 Lipofectamine 2000转染试剂及总RNA提取液（美国Invitrogen公司），人RB细胞株Y79（上海通蔚生物），RPMI-1640培养液、胎牛血清、胰蛋白酶和青-链霉素双抗（美国Gibo公司），逆转录及PCR扩增试剂（大连宝生物），miR-142和U6（上海生工生物），miR-142模拟物和阴性对照序列（上海吉荧生物），噻唑蓝（MTT）液（南京信帆生物），二甲基亚砜（DMSO）（淄博博安公司），Transwell小室和基质胶（美国Corning公司），UV-1900双光束紫外分光光度计（上海美析公司），实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 组织中miR-142表达：取组织，按试剂盒说明提取总RNA，使用紫外分光光度计对其纯度开展检测，并通过琼脂糖凝胶电泳检验其完整性，使用逆转录试剂盒反转录为cDNA，用实时荧光定量PCR仪按PCR扩增试剂盒说明扩增引物，序列：miR-142：上 游：5’-CGCGCCTGTAGTGTTTC CTACTTT-3’，下游：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAG GTA-3’；U6：上游：5’-GCTTCGGCAGCACATATA CTAAAAT-3’，下游：5’-TTCACGAATTTGAGTGTC AT-3’。条件：94℃3 min，94℃30 s，65℃20 s，72℃30 s，36个循环，用2-△△Ct法计算RB和癌旁组织中miR-142表达量。

1.3.2 细胞培养：使用RPMI-1640培养液（含10g/dl胎牛血清和青-链霉素双抗）在37℃，含5ml/dl CO2条件下培养Y79。待融合度在80%以上时，胰酶消化，传代培养。利用Lipofectamine 2000转染试剂对对数生长期细胞进行分组转染：①miR-142模拟物组：转染miR-142模拟序列：正义链：5’-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU-3’，反义链：5’-UAGUGCUUUCUACUUUAUGUU-3’；②阴性对照组：转染阴性对照序列：正义链：5’-UUCUCCG AACGUGUCACGUTT-3’，反义链：5’-ACGUGACA CGUUCGGAGAATT-3’；③空白组：不作处理。处理后，各组培养48h。

1.3.3 检测细胞中miR-142表达：收集各组转染48h后细胞，其他操作步骤见1.3.1。

1.3.4 MTT实验：取不同组细胞，按每孔6×103个细胞接种在96孔板，37 ℃培养。分别在12 h，24 h，48 h，72 h和96 h时，各孔加入MTT液（5mg/ml）20 μl，孵育4h，除去培养液，加入DMSO 150 μl，室温反应10 min，利用酶标仪对各孔吸光度A值检测。重复操作3次。

1.3.5 Transwell实验：细胞迁移：用胰酶消化各组转染48 h后细胞，离心，用无血清培养液按密度2.5×106/ml重悬细胞，在Transwell上室加入悬液200 μl，下室则加入600 μl含10g/dl胎牛血清培养液，培养24 h，用无菌棉签将散落细胞拭去，甲醛固定，结晶紫染色，倒置显微镜下观察穿膜细胞数。细胞侵袭：用培养液稀释基质胶，平铺于小室上室，风干，其它实验步骤同检测细胞迁移。

1.4 统计学分析 采用IBM SPSS 21.0软件进行数据统计分析，RB和癌旁组织中miR-142表达比较、不同临床指标间比较采用t检验，三组细胞中miR-142表达、细胞增殖活性及迁移和侵袭力比较采用单因素方差分析和LSD多重检验的两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RB和癌旁组织中miR-142表达比较 RB组织中miR-142表达量（0.34±0.12）低于癌旁组织（0.99±0.16），差异有统计学意义（t=29.102，P＜0.01）。

2.2 不同临床指标RB组织中miR-142表达比较 见表1。miR-142表达量在不同性别、年龄和眼侧差异均无统计学意义（均P＞0.05），而在不同分化程度、是否神经浸润和淋巴结转移中差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 miR-142在RB组织中表达量与临床指标相关性（±s）

表1 miR-142在RB组织中表达量与临床指标相关性（±s）

项 目 n miR-142表达量 t值 P值性别 男 48 0.33±0.12 1.262 0.211女31 0.36±0.11年龄（岁） ＜4 47 0.33±0.12 0.864 0.390≥4 32 0.36±0.13眼侧 左侧 42 0.36±0.13 1.274 0.207右侧 37 0.32±0.11分化程度 未分化型 36 0.30±0.11 3.056 0.003分化型 43 0.38±0.12神经浸润 是 41 0.30±0.11 3.495 0.001否38 0.39±0.12淋巴结转移 是 31 0.29±0.11 2.991 0.004否48 0.37±0.12

2.3 三组细胞中miR-142表达比较 miR-142模拟物组、阴性对照组和空白组细胞中miR-142表达量分别为2.42±0.11，1.02±0.09，1.01±0.10，三组数据比较差异有统计学意义（F=398.036，P＜0.01）；相比于阴性对照组和空白组，miR-142模拟物组细胞中miR-142表达量升高（P＜0.05）。

2.4 三组细胞增殖活性比较 见表2。相比于阴性对照组和空白组，miR-142模拟物组在24 h，48 h，72 h和96 h时吸光度A值均降低（P＜0.05）。

表2 三组细胞增殖活性比较（吸光度A值，±s）

表2 三组细胞增殖活性比较（吸光度A值，±s）

注：#与空白组比较，t=2.68, 3.37, 4.50, 3.99, 均P＜0.05；*与阴性对照组比较，t=3.28, 3.75, 3.48, 7.34,均P＜0.05。

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2.5 三组细胞迁移与侵袭力比较 见表3。相比于阴性对照组和空白组，miR-142模拟物组迁移细胞数和侵袭细胞数均降低，差异有统计学意义（t=6.549, 5.237；7.724, 8.103, 均P＜0.05）。

表3 3组细胞迁移和侵袭力比较（±s，个）

表3 3组细胞迁移和侵袭力比较（±s，个）

项 目 miR-142模拟物组 阴性对照组 空白组 F值 P值迁移细胞数 107.83±3.54*# 129.50±7.29 131.83±6.74 28.394 ＜0.001侵袭细胞数 96.00±5.87*# 116.17±7.39 120.17±4.36 27.982 ＜0.001

3 讨论

视网膜母细胞瘤（RB）作为对儿童生命安全及视功能危害程度高且最为常见的眼内恶性肿瘤，病因及发病机制尚未完全清楚[9]。目前，临床上对于RB的治疗尽量保留眼球及视力，常采取的保守治疗方法包括放疗、化疗、温热疗法、激光光凝治疗等，但均存在一定的不良反应和（或）并发症[10]，对于晚期的RB患者，手术摘除依然是最有效的治疗手段[11]，但晚期RB患者预后依然较差，远处器官转移是导致患者死亡的主要原因[12]，因此，亟需寻找更为有效且安全的治疗方法。随着分子靶向治疗技术的成熟和应用[13]，为RB的治疗带来了新的契机。miRNA作为广泛存在于生物体内的进化上高度保守的短链RNA，通过与其靶基因互补配对而促使靶基因降解，从而实现对生物功能的调节[14]，研究表明[15]，miRNA参与调控了多种恶性肿瘤发生、进展过程，已被作为靶基因用于肿瘤分子治疗。miR-142作为miRNA中的一员，已被发现参与了甲状腺癌细胞生长和转移[16]，与结直肠癌细胞增殖、凋亡和放射敏感度有关[17]。亦有研究[18]指出，miR-142-5p作为肿瘤抑制因子，通过抑制黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase 9, MMP9）的表达，以及通过靶向PIK3CA的磷脂酰肌醇3-激酶/AKT信号通路来抑制胰腺癌的迁移和侵袭。本研究结果显示，miR-142在RB组织中表达量低于癌旁组织，说明RB组织中miR-142呈低表达，miR-142可能作为抑癌基因参与了RB发病。本研究结果显示，miR-142表达量在未分化型、神经浸润与淋巴结转移的RB组织中明显减少，miR-142可能参与了RB恶性进展的临床病理指标有关，提示miR-142可能参与了RB恶性进展。

为进一步明确miR-142在RB发病中的作用，本研究采用转染miR-142模拟物的方法观察对人RB细胞株Y79的生物学功能的影响，结果显示，miR-142模拟物组细胞中miR-142表达量高于阴性对照组和空白组，说明转染模拟物后Y79细胞中miR-142表达量显著升高，成功转染。本研究显示，相比于阴性对照组和空白组，24，48，72和96 h时miR-142模拟物组细胞吸光度A值均降低，说明miR-142可能与细胞增殖有关，在转染模拟物后细胞增殖活性被显著抑制。本研究结果表明，上调miR-142表达可显著减少细胞迁移和侵袭。

综上所述，RB患者组织中miR-142表达量降低，且与分化程度、神经浸润和淋巴结转移有关，上调miR-142表达可抑制Y79细胞增殖、迁移和侵袭能力，有望成为RB分子靶向治疗新的靶位，但其具体作用机制有待进一步开展相关研究予以明确。