竞争性内源性RNA在急性髓系白血病中的研究进展

刘 睿，王玉明(昆明医科大学第二附属医院检验科, 昆明 650101)

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是最常见且进展迅速的造血系统恶性肿瘤之一，约占急性白血病的70%～80%，其特征是未成熟的髓系细胞异常增殖和分化受阻，对患者生命造成了严重的威胁[1-2]。尽管近些年AML的研究已取得显著进展，但患者中普遍存在化疗耐药性和复发率高等问题，预后一般较差[3-4]。人类基因组测序分析显示，70%基因组序列能够转录成RNA，然而只有约2%的RNA具有翻译为编码蛋白的能力，绝大部分RNA都是非编码RNA[5]。随着高通量测序技术的不断发展，非编码RNA在癌症的发生发展、诊断和治疗方面的重要作用已被逐渐挖掘。同时，单基因或单一通路已不能完全阐明疾病发生的机制，现在研究者把注意力转移到多基因调控网络上来，随着研究的深入，发现了一种新的竞争性内源性RNA (competing endogenous RNA，ceRNA)网络。现就近期发现的ceRNA在AML中的研究进展作一综述。

1 ceRNA假说

2011年，SELMENA等[6]提出了ceRNA假说，揭示了一种新的基因表达调控模式。该假说指出mRNA之间可以通过miRNA反应元件(miRNA response element，MRE)竞争性结合相同的miRNA来调节彼此的表达，这种竞争性结合miRNA的作用又被叫做“miRNA海绵作用”（microRNA sponges）[7]。目前ceRNA包括长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、环状RNA（circRNA）、假基因、人工miRNA抑制剂及病毒miRNA抑制剂 等，miRNA反应元件（miRNA response element，MRE）多数位于它们的3’非翻译区，也可出现在5’非翻译区，甚至编码序列。各类RNA之间存在通信网络，它们之间共有的MRE数量越多，共同调节靶基因的可能性也就越大。ceRNA不是一种新发现的RNA分子，而是一种庞大而精细的基因表达调控机制[6]，其表达水平受多种因素的影响，例如ceRNA的亚细胞定位，miRNA与其海绵的结合亲和力等，这些因素的异常可能对癌症的发生、维持或进展产生深远的影响[8-9]。大量实验证实了ceRNA网络在不同肿瘤中广泛存在，早期胃癌研究[10]中发现了lncRNA HOTAIR可作为一种ceRNA，通过海绵结合miR-331-3p来调节HER2在胃癌中的表达，除此之外，在肝癌[11]、乳腺癌[12]、胆管癌[13]、结直肠癌[14]等中都有相关报道。

图1 ceRNA相互作用示意图

2 lncRNA作为ceRN A在AML中的作用

lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，广泛存在于基因组中，因存在多种外显子转录，所以大部分不能被翻译成特定蛋白发挥作用。但可以与DNA,RNA和蛋白质结合[15]，lncRNA参与转录和转录后调控等多种细胞过程，功能上涉及调节蛋白质的活性和定位、RNA降解、支架、海绵等作用[16-18]。随着基因组分析技术的发展，目前已鉴定出许多与生物学相关的lncRNA在各种类型的肿瘤细胞中均存在异常表达，揭露了lncRNA在AML中的关键作用[17,19]。

近期研究表明，lncRNA作为ceRNA中的一员，与AML的发生和发展密切相关。LI等[20]的研究表明，在AML患者的骨髓样本中，RAET1K和miR-503-5p的表达呈显著负相关，而体外实验结果显示，RAET1K下调后可通过竞争性吸附miR-503-5p来上调INPP4B的表达，进而抑制白血病的发生。另有研究表明[21]，AML中可能存在UCA1/miR-126/RAC1调控网络影响AML的进程，敲低lncRNA UCA1可抑制AML细胞的迁移、侵袭，促进AML细胞的凋亡，因此UCA1可作为AML的潜在治疗靶点。同样，XING等人[22]发现lncRNA HOTAIR这一致癌基因在AML细胞系中显著过表达，它通过竞争性结合miR-193a来调节AML细胞中c-Kit的表达，而miR-193a是一种重要的肿瘤抑制性miRNA，HOTAIR与结合miR-193a进一步抑制了其功能，导致了疾病的发生及恶化。CHEN等[23]报道了lncRNA作为ceRNA与自噬之间的潜在联系，生物信息学分析表明lncRNA HOTAIRM1可能具有ceRNA的功能，实验结果显示HOTAIRM1可 以 与miR-20a，miR-106b和miR-125b结 合，这三种miRNA分别对应的靶基因ULK1，E2F1和DRAM2都是自噬过程中不可或缺的基因，HOTAIRM1通过自噬相关途径促进了PML-RARA融合基因的降解，当细胞中HOTAIRM1的表达量下调时，自噬小体形成也会受到抑制。这些研究揭示了一个在AML进展中的新的lncRNA-miRNAmRNA调控网络，为lncRNA介导的ceRNA机制与AML发展之间的联系提供了证据。

化疗耐药性是影响AML患者生存和导致治疗失败的重要原因之一[24]。lncRNA已被证实参与白血病耐药性相关的生物学功能。在AML的临床治疗中，阿霉素这类的蒽环类化疗药物常表现出较低的化疗敏感性。值得注意的是，ZHANG等人[25]观察到了抗阿霉素的AML细胞和经过阿霉素治疗后的儿童AML患者骨髓样本中，UCA1的表达都异常上调，功能学结果显示，敲除UCA1可抑制miR-125a/HK2途径的糖酵解，从而抑制儿童AML细胞的耐药性，在克服儿童AML化疗耐药中起着积极作用，有助于更好地理解AML化疗耐药的分子机制。同样，有研究发现lncRNA HOXA-AS2通过miR-520c-3p /S100A4途径增加了AML细胞对阿霉素的耐药性[26]。SUN等[24]报道了lncRNA KCNQ1OT1在阿霉素耐药机制的研究，KCNQ1OT1通过吸附阿霉素耐药的AML细胞中miR-193a-3p来诱导Tspan3表达，从而促进AML细胞的进展和对阿霉素的药物抗性。综上所述，越来越多的研究表明，基于lncRNA介导ceRNA网络的研究为AML克服耐药性提出了新的理论思路，阐明相关的分子机制有助于制定合理有效的治疗策略。

此外，越来越多的研究开始使用癌症基因组图 谱（the cancer genome atlas，TCGA）、基 因 表达综合数据库（gene expression omnibus，GEO）等公共数据库来构建更全面的ceRNA调控网络并挖掘更准确的预后标记物。为了确定在青少年和儿童患者中lncRNA是否与细胞遗传学正常的急性髓系白血病（cytogenetically normal AML，CNAML）的预后相关，YIN等[27]从TCGA数据库选择了27例18岁以下CN-AML患者，构建了一个生存特异性ceRNA网络，并分析了这些ceRNA网络与患者临床信息的关联性。同时，为了更好地了解AML的异常基因表达调控并寻找可能的预后标志物，CHENG等[28]从TCGA，GEO等数据库获得了AML患者和正常样本的转录组数据，建立了6个circRNA，32个lncRNA，8个miRNA和6个mRNA共同参与的预后ceRNA网络，全面阐明AML的转录后调控机制，并找到了更有效的诊断、治疗和预后预测指标。虽然上述结果仅基于公共数据库分析得到，后期仍需要更多的基础研究来证实，但这些研究仍体现了ceRNA 在判断AML患者预后中的重要作用。

越来越多的研究基于ceRNA机制证实了lncRNA在调控AML疾病进程中占据重要地位，为揭开lncRNA调控功能带来更多可靠的证据，见表1。

表1 AML中lncRNA介导的ceRNA调控网络

3 circRNA作为ceRNA在AML中的作用

circRNA是一类特殊的非编码RNA，其长度为数百至数千个核苷酸，其结构与线性RNA不同，既没有5’至3’端极性，也没有多聚腺苷酸尾，通过反式剪切使3’端和5’端首尾相连，形成共价闭环结构[36-37]。由于circRNA这种特殊的结构，使其不易被RNA酶识别及降解，因此具有高度稳定性、保守性等特点，是肿瘤中生物标志物的理想选择，在各种癌症中具有潜在的诊断价值。circRNA也可通过MRE与miRNA结合，成为ceRNA家族中又一个新的研究热点，在AML发生、进展、预后中发挥着重要的作用[38]。

研究发现[39]，儿童AML患者的血液样本和AML细胞中circ_0005774的表达明显升高，作为miR-192e5p的海绵，通过调节miR-192e5p/ULK1轴部分地抑制AML细胞增殖和促进AML细胞凋亡。YUAN等[40]分析了儿童AML患者和健康对照的各6份骨髓样本，发现儿童AML患者中有273个circRNA上调，296个circRNA下调。进一步研究发现，circ-0004136在儿童AML患者中显著上调，可通过充当miR-142的海绵促进细胞增殖，是诊断儿童AML患者的生物标志物。另有研究指出[41]，circ_0002232低表达的患者有更好的总生存率，并揭示了AML患者中潜在的ceRNA网络，circ_0002232可能通过海绵吸附miR-92a-3p影响PTEN的表达和AML的进程。PTEN是一个双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，位于染色体10q 23.3，具有9个外显子和8个内含子，PTEN的表达对多种肿瘤的发生、发展有着重要影响。另外，PING等[42]研究发现，与缺铁性贫血患者相比，AML患者骨髓样本中circ_0009910显著上调，这可用来预测AML患者的不良风险及预后，敲除circ_0009910能抑制AML细胞增殖，并通过海绵吸附miR-20a-5p诱导细胞凋亡。

除此之外，circRNA与发生基因突变的AML患者也有潜在联系。FLT3基因定位于染色体13q12，FLT3-ITD是AML最常见的突变之一，约占世界所有AML病例的25%，这类患者易复发、预后相对较差且生存率低，因此与FLT3-ITD有关的靶向治疗成为研究热点。ZHANG等[43]研究发现circ_0000370在FLT3-ITD阳性的AML中显著增加，并且circ_0000370可以通过在AML细胞系中吸附miR-1299来调节S100A7A的表达，进而影响FLT3-ITD阳性AML的进展，该结果为FLT3-ITD阳性AML患者提供了多种治疗靶点和诊断生物标志物。

目前，circRNA在介导AML化疗耐药中的作用仍知之甚少，需要进一步研究。SHANG等[44]构建了对阿霉素耐药的THP-1细胞系，通过分析其与普通THP-1细胞系的基因表达谱发现，circPAN3在阿霉素耐药的THP-1细胞系中显著上调，同样，在难治性和复发性的AML患者中也得到了验证。生物信息学和荧光素酶分析结果证实，circPAN3依赖于miR-153-5p/miR-183-5p-XIAP轴来介导AML细胞的耐药性，circPAN3可以作为预测AML患者化疗效果的重要指标。这些结果说明circRNA是AML化学耐药性的关键分子，但仍需要更多数据来阐明其具体机制。

不同的RNA参与竞争miRNA，形成复杂的以miRNA为核心的调控网络，lncRNA和circRNA在此调控网络中引入了更为复杂交错的关系。例如，lncRNA HOTAIRM1和circ_0009910可以与相同的miR-20a相互结合，从而在AML中发挥不同的功能。但是，目前尚不清楚lncRNA和circRNA如何相互竞争以结合相同miRNA，因此有必要进一步探讨AML中lncRNA与circRNA之间的关系，阐明AML的发病机制。总结来说，异常表达lncRNA和circRNA参与AML的发生发展，且与患者预后和治疗耐药性密切相关，是AML潜在的治疗靶点。

4 假基因作为ceRNA在AML中的作用

假基因也称伪基因，是进化过程中的不具有编码功能的残留物。这类基因与功能基因序列相似,因终止密码子提前、碱基缺失或者插入等原因而丧失了编码功能蛋白质能力。长期以来假基因被认为是一类“垃圾序列”，但目前已发现假基因在多种恶性肿瘤中可以发挥关键和多方面的作用[45]。同样，假基因与其相应的编码基因类似，包含miRNA结合位点，能够发挥“miRNA海绵作用”，导致miRNA水平和活性下降，进而上调靶基因的表达，是理想的一类ceRNA。

PTENPl是PTEN的假基因，其序列与PTEN呈高度同源性，通过共享的MRE结构，PTENP1可以与抑癌基因PTEN竞争性结合多种miRNA分子，进而影响肿瘤的发展进程[46]。王翠翠等[47]证实急性白血病患者中PTEN及PTENPl基因的表达均低于正常对照组，两者的表达水平呈正相关，并指出该结果可能是PTEN mRNA及PTENPl转录产物通过竞争同一种miRNA实现的。在原发性肾透明细胞癌的研究中，YU等[48]研究发现，由于甲基化作用，PTENP1在原发性肾透明细胞癌的组织和细胞中低表达或不表达，TENP1和PTEN的表达是相关的，并且两种表达都与miR21的表达呈负相关，在细胞中过表达 PTENP1可以调控miR21，进而抑制肾透明细胞癌细胞的增殖、侵袭和转移，并增强肾透明细胞癌细胞对顺铂和吉西他滨等化疗药物的敏感度。这些结果表明，PTENP1在恶性肿瘤的进展中作为一种ceRNA发挥作用。目前假基因在急性白血病的研究尚处于初步阶段，国内外研究报道较少，相信会有更多的学者关注假基因，阐明它在基因调控水平上影响肿瘤发生发展的作用机制，发掘新的肿瘤标志物。

5 人工miRNA抑制剂及病毒miRNA抑制剂

人工miRNA抑制剂主要包含两类：人工合成的miRNA反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASO）和基于载体表达的miRNA吸附物[49]。前者与细胞内天然的miRNA吸附物不同，主要是由和miRNA几乎完全互补的小单链RNA寡核苷酸组成的，可通过2’-O-甲基化或形成一个发夹结构来增强其稳定性。后者可以表达3’UTRs（富集多个miRNA结合位点）的基因载体，可在哺乳细胞内的强启动子的作用下进行稳定表达，其转录产物能够起到miRNA“海绵”的作用，结合目的miRNA并抑制其功能[49-50]。

病毒miRNA抑制剂，是病毒产生的非编码RNA，在病毒感染宿主时其能与机体内的 miRNA相结合，引起疾病的发生[51]。病毒可通过多种机制来控制宿主基因表达，研究表明病毒也可产生非编码RNA来调控S宿主靶基因表达。如在疱疹病毒转染的T细胞中高表达的富含尿嘧啶的HSURs，具有多个宿主miRNA家族（miR-16，miR-27a和miR-142-3p）的结合位点，可调节目的基因表达水平[50]。由此可见，虽然相关研究报道较少，但人工miRNA抑制剂及病毒miRNA 抑制剂为临床研究提供了新思路。

6 展望与小结

通过 ceRNA调控机制，各类RNA分子之间可以通过竞争性结合miRNA来实现相互调控，ceRNA假说赋予了非编码RNA更全面、更广泛的生物学功能。AML是一种发病率和复发率较高的复杂疾病，大多数患者存在治疗中产生耐药，缓解后仍会复发，预后不理想等问题。所以有必要探索用于AML诊断、预测和治疗靶点的新生物标志物，以制定更有效的监测和治疗方案。相较于假基因，lncRNA和circRNA是作为ceRNA参与AML发展进程研究最多的非编码RNA，在急性白血病治疗靶点的发掘及临床转化中极具潜力。现目前对ceRNA机制的研究仍处于初期，部分研究仅通过生物信息学验证了靶向关系，且每种ceRNA调控网络研究的例子较少，ceRNA参与肿瘤的发病机制是复杂的，希望这些预测在未来的实验中得到充分验证，后继仍需更多深入全面的研究阐明相关机制，并探索临床应用的可行性。

自ceRNA假说提出以来，有大量实验证实了ceRNA网络在疾病中广泛存在，但仍存在部分争议，认为大多数活跃miRNA不易受到ceRNA竞争的影响，ceRNA变化不足以抑制miRNA活性[50]。尽管如此，ceRNA假说作为调节基因表达的一种合理的通用机制目前已被广泛认可并运用。总之，ceRNA在肿瘤中发挥的作用不容忽视，不仅为AML深入研究提供了全新的视角，同时也为寻找肿瘤新型的生物标志物及潜在的靶向治疗提供了理论基础。