老年慢性心力衰竭患者血清人类母系表达基因3的水平与预后的相关性研究

陈 伟，侯湘岭（保定市第二医院心血管内科，河北保定 071000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）为常见心血管疾病之一，多发于老年人，发病与神经内分泌、激素代谢、炎性因子等多种因素有关，可引起脏器血流量灌注不足，造成休克、心脏骤停甚至死亡等严重后果[1]。积极进行病情和预后评估是改善CHF预后的关键。近年来，非编码RNA在各种疾病发病中的作用及其表达受到临床关注，既往研究发现[2]，非编码RNA参与心血管疾病的发病。刘崇韬等[3]的研究证实，急性心肌梗死患者的血清人类母系表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）显著升高，可作为急性心肌梗死诊断和病情评估的标志物，但有关其在CHF患者中表达的相关研究仍较为缺乏。此次研究通过分析老年CHF患者血清MEG3表达水平，探讨其水平表达与预后的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回顾性分析保定市第二医院2019年1月～12月收治的118例CHF患者的临床资料，其中男性62例，女性56例；年龄60～80（66.83±5.59）岁；发病至入院时间1～4 h，平均2.95±0.61h。纳入标准：①符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》[4]中诊断标准；②年龄60～75岁；③美国纽约心脏病学会（New York heart assocication，NYHA）分级为Ⅱ～Ⅲ级；④左室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）＜50%；⑤入组前3个月内无相关药物治疗史或临床新诊断为CHF未治疗患者；⑥完成随访；⑦临床资料完善。排除标准：①伴心肌梗死、心肌炎等其他心脏疾病者；②有先天性心脏病史者；③伴感染、恶性肿瘤、血液系统疾病者；④伴严重肝、肾功能障碍者；⑤临床资料不全。

所有患者住院期间均接受规范药物治疗，收集相关资料，根据心功能NYHA分级[5]，将研究对象分为心功能Ⅱ级组和心功能Ⅲ级组，2组性别、年龄、体质量指数、吸烟史、饮酒史、心血管病家族史等基线资料的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。另根据随访结果将患者分为预后不良组（随访出现心脏事件者）和预后良好组（随访未出现心脏事件者），比较两组一般资料、血细胞检测（血红蛋白、白细胞、淋巴细胞计数）、血糖和血脂、血清学指标、心脏彩超等结果。本研究方案得到医学伦理委员会批准后执行。

1.2 仪器与试剂 彩色超声诊断仪（飞利浦公司）；肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB），心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）的酶联免疫吸附检测试剂盒（上海华壹生物）；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（苏州阿尔法生物实验器材有限公司）；Trizol（上海索宝生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 心脏彩超检查：使用彩色超声诊断仪沿左室长轴测定左室收缩末期内径（left ventricular endsystolic dimension，LVESD）、左室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD），取心尖四腔切面测左室射血分数（left wentricular ejection fractions, LVEF）。共测3个不同心动周期，检查由5年以上临床经验的专科医生进行。

1.3.2 实验室检测：患者均于心功能检查当天采集肘正中静脉血6 ml，分为2管，其中1管于3 000 r/min速度下离心15 min，留取上清液，采用酶联免疫吸附法测定CK-MB，cTnI。荧光免疫法测定B型尿钠肽（B-type natriuretic peptide，BNP）水平。另外1管取250 μl血清样品，加入750 μl的Trizol，采用Real-time PCR检测血清MEG3表达，根据目标基因设计合成上下游引物进行PCR扩增，内参物为GAPDH。PCR反应在定量PCR反应仪上进行，所得结果用2-△△Ct表示[6]。

1.3.3 随访结果：所有患者出院后均通过电话+门诊复查的形式进行了至少12个月的随访，每个月电话随访1次，间隔3个月回院复查1次心功能，记录根据随访12个月期间心脏事件，包括心力衰竭加重再入院、心源性死亡、全因死亡等，出现心脏事件者参照《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》[4]进行治疗。

1.4 统计学分析 采用SPSS19.0进行统计学处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，比较采取t检验；计数资料用例（%）表示，比较采取χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义；相关性采用Spearman相关分析，采用多因素Logistic回归分析明确老年CHF预后的影响因素，绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线分析血清MEG3表达预测患者预后的价值。

2 结果

2.1 不同心功能分级患者的血清学指标及心脏彩超参数比较 见表1。心功能Ⅲ级患者的血清CKMB，cTnI，BNP，MEG3表达和LVESD，LVEDD高于Ⅱ级患者，LVEF低于Ⅱ级患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 不同心功能分级患者血清学指标及心脏彩超参数比较（±s）

表1 不同心功能分级患者血清学指标及心脏彩超参数比较（±s）

项 目 心功能Ⅱ级（n=32）心功能Ⅲ级（n=86） t值 P值CK-MB（IU/L） 57.70±5.46 68.19±6.53 8.090 0.000 cTnI （ng/L） 1.95±0.47 2.37±0.63 3.429 0.001 BNP（pg/ml） 336.43±67.38 581.21±98.73 12.932 0.000 MEG3（2-△△Ct） 7.32±2.25 11.65±3.09 7.237 0.000 LVESD（mm） 39.63±7.28 44.18±8.47 2.690 0.008 LVEDD（mm） 53.05±8.78 58.73±9.02 2.956 0.004 LVEF（%） 43.19±5.66 37.55±5.94 4.643 0.000

2.2 心功能分级与血清CK-MB，cTnI，MEG3表达及LVESD，LVEDD，LVEF的相关性 经Spearman相关分析，心功能分级与CK-MB（r=0.358），cTnI（r= 0.339），BNP（r= 0.406），MEG3表达（r= 0.472）和LVESD（r= 0.378），LVEDD（r= 0.394）均呈显著正相关，与LVEF（r= -0.443）呈显著负相关，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

2.3 不同预后患者的临床资料比较 见表2。随访结果显示，118例患者中预后不良36例，预后良好82例。预后不良组患者年龄71～80岁和NYHA分级Ⅲ级的占比，血清CK-MB，cTnI，BNP，MEG3表达和LVESD，LVEDD显著高于预后良好组，LVEF显著低于预后良好组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 预后良好组与预后不良组的单因素比较[n（%），±s]

表2 预后良好组与预后不良组的单因素比较[n（%），±s]

类 别 预后良好组（n=82） 预后不良组（n=36） t/χ2 P值性别 男 43（52.44） 19（52.78） 0.001 0.973女39（47.56） 17（47.22）年龄（岁） 60～70 55（67.07） 16（44.44） 5.345 0.021 71～80 27（32.93） 20（55.56）体质量指数（kg/m2） ≤26 47（57.32） 22（61.11） 0.148 0.700＞26 35（42.68） 14（38.89）吸烟史 有 20（24.39） 11（30.56） 0.491 0.483无62（75.61） 25（69.44）饮酒史 有 23（28.05） 12（33.33） 0.335 0.563无59（71.95） 24（66.67）心血管病家族史 有 7（8.54） 2（5.56） 0.299 0.585无75（91.46） 34（94.44）NYHA分级 Ⅱ级 28（34.15） 4（11.11） 6.716 0.009Ⅲ级 54（65.85） 32（88.89）糖尿病 有 24（29.27） 11（30.56） 0.020 0.888无58（70.73） 25（69.44）高血压 有 31（37.80） 16（44.44） 0.460b 0.498无51（62.20） 20（55.56）血红蛋白 （g/L） 107.62±38.43 114.71±32.75 0.996 0.321白细胞 （×109/L） 8.19±2.44 7.45±2.01 1.675 0.097淋巴细胞 （×109/L） 1.50±0.47 1.36±0.39 1.637 0.104三酰甘油 （mmol/L） 1.17±0.41 1.09±0.37 1.014 0.313低密度脂蛋白 （mmol/L） 2.21±0.66 1.99±0.58 1.764 0.080 CK-MB（IU/L） 56.91±6.76 84.84±9.79 14.855 0.000 cTnI（ng/L） 1.87±0.44 3.14±0.87 7.876 0.000 BNP（pg/ml） 320.91±74.13 956.53±121.72 27.650 0.000 MEG3表达（2-△△Ct） 7.19±2.04 17.96±4.81 12.237 0.000 LVESD（mm） 36.75±7.79 57.06±10.05 10.326 0.000 LVEDD（mm） 52.59±7.11 67.67±9.46 8.189 0.000 LVEF（%） 42.38±5.93 31.56±4.43 10.716 0.000

2.4 老年CHF患者预后的多因素分析 见表3。以患者预后作为因变量（预后不良=1，预后良好=0），将单因素分析中P＜0.05的变量纳入多因素Logistic回归分析，自变量处理：年龄赋值：60～70岁=0，71～80岁=1；NYHA分级：Ⅱ级=0，Ⅲ级=1；CK-MB，cTnI，BNP，MEG3表达，LVESD，LVEDD，LVEF均以原始数据录入。结果显示，年龄（OR=3.615，95%CI：1.189～10.991），NYHA分级（OR=3.911，95%CI：1.324～11.553），血清CK-MB（OR=3.554，95%CI：1.397～9.041），cTnI（OR=4.193，95%CI：1.583～11.106），BNP（OR=2.842，95%CI：1.319～6.124），MEG3表达（OR=5.003，95%CI：1.297～19.298），LVEF（OR=0.396，95%CI：0.184～0.876）是预后影响因素（均P＜0.05）。

表3 老年CHF患者预后的多因素Logistic回归分析

2.5 血清MEG3表达预测老年CHF患者预后的ROC曲线 见图1。以患者随访12个月内出现心脏不良事件为终点，血清MEG3表达为自变量，绘制血清MEG3表达预测老年CHF患者预后的ROC曲线下面积0.874（95%CI：0.778～0.948），截断值为12.52×2-△△Ct时，敏感度与特异度分别为0.869，0.724。

图1 血清MEG3表达预测老年CHF患者预后的ROC曲线

3 讨论

慢性心力衰竭（CHF）是一种复杂的病理状态，一旦发生即便处于临床稳定阶段，病情仍会不断发

展。证据表明[7]，CHF患者出现明显症状后的5年和10年存活率分别在40%和20%左右。早期诊断并积极进行预后评估对提高CHF患者治疗效果、预防并发症、提高生存率具有重要意义。CHF发病机制复杂，加之个人体质的不同，给患者的预后评估带来困难。

研究发现[8]，CHF患者的多种生物标志物浓度升高，其在患者预后评估中的作用也受到认可，是疾病预后预测的简便方法。如何在众多生物标志物中寻找到敏感度和特异度高、检测快速准确的理想生物标志物引起关注。以往临床多采用血清BNP对CHF患者预后进行评估和预测，BNP水平的变化与心室容积、压力负荷等有关，CHF患者心脏容量负荷增大，心室壁压力增大，使心肌细胞分泌更多的BNP，因此CHF患者的血清BNP水平异常升高，且与心功能分级呈正相关[9]。CK-MB，cTnI均是反映心肌细胞损伤程度的标志物，也常被临床用于CHF患者的预后评估中。CHF患者随着病情的加重，心肌损伤程度加重，心功能分级也因此升高[10]。本研究结果也证实，心功能Ⅲ级患者的血清CK-MB，cTnI，BNP均显著高于Ⅱ级患者，且与心功能分级呈正相关，是CHF患者预后的影响因素（P＜0.05），与以往研究结论相符[11]。另外，LVEF也是CHF预后的影响因素，这可能与CHF患者交感神经系统、肾素-血管紧张素系统被激活，水钠潴留，损伤心肌并引起结构重塑，造成心肌收缩性和顺应性下降，LVEF减小[12]。而心肌收缩性和顺应性下降是CHF患者心脏不良事件的重要病理过程，这是LVEF成为预后影响因素的主要原因之一。

长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lnc RNAs）是无蛋白质编码功能的RNA，占人类基因组基因98%左右，广泛参与机体生物学功能[13]。研究发现[14]，lncRNAs在心脏发育、心血管疾病也有一定调控作用，可为心血管疾病提供治疗靶点。有专家[15]对心肌成纤维细胞的全lncRNA测序发现，lncRNA MEG3在心肌成纤维细胞中高表达且呈现差异。进一步体内外实验证实[16]，沉默MEG3基因可启动子区域结合，预防心肌纤维化和心脏收缩与舒张功能失调。在心脏方面对lncRNAs的研究仍处于起步阶段，有关lncRNA MEG3与CHF疾病的研究仍鲜有报道。外周血中含稳定表达的lncRNAs，其在心肌组织中的表达具有组织特异度，对心肌重塑、心肌再生等有独特功能特性，这是其作为心血管疾病靶向分子和生物标志物的理论基础[17]。本研究检测了CHF患者的血清MEG3表达，结果显示，心功能Ⅲ级患者的血清MEG3表达显著高于Ⅱ级患者，且与心功能分级有显著相关性。这一结果考虑与MEG3可调控心肌细胞凋亡有关，CHF患者早期，心脏压力增大、细胞凋亡，触发心肌细胞发生代偿性增生。随着病情进展，心肌负荷进一步增加，心肌细胞的增生/凋亡平衡再次被打破，导致心功能进行性下降。MEG3可诱导心肌细胞凋亡，加速心肌细胞增生/凋亡平衡的破坏，因此MEG3高表达患者的心功能分级往往更高。VIERECK等[18]的研究也发现，正常状态下人血清lncRNA MEG3表达极低，心肌梗死的发生会造成血清lncRNA MEG3大幅上调，其对于心肌损伤的评估有一定价值，与本研究结论一致。血管内皮细胞位于血管最里层，内皮细胞障碍会引发高血压、动脉粥样硬化等。再内皮化是血管损伤修复的关键环节，依赖于内皮细胞的增殖和迁移，MEG3表达对内皮细胞增殖既有促进作用也有抑制作用，与所处的细胞周期和条件以及MEG3表达水平的不同有关，因此MEG3表达对血管形成、心脏重构等过程具有调控作用[19]。已有证据表明[20]，冠状动脉疾病大鼠的血清MEG3表达较正常动脉组织的大鼠出现明显变化。动物实现发现[21]，微小RNA-21可调控内皮细胞增殖和血管生成，拮抗心肌细胞损伤。而MEG3可通过对微小RNA-21表达的调控影响心肌细胞的增殖和血管内皮功能，从而保护心肌细胞，改善心功能。也有专家发现[22]，心脏重构早期抑制MEG3表达可降低基质金属蛋白酶2活性从而减轻心肌纤维化和肥大，保护心脏。本研究多因素Logistic回归分析显示，血清MEG3表达是预后影响因素，对预后有较高的预测价值，加之MEG3表达情况可通过血清样本进行检测，可重复性高，对患者损伤小。夏芳等[23]分析了5种生物标志物诊断心力衰竭的价值，但其对预后的预测价值有限。黄晖等[24]的研究显示，强离子隙对急性心力衰竭也有一定的预测价值，但对检测设备的要求较高，且需要动态监测阴离子隙、血液钾离子、pH值等多项指标来计算强离子隙，过程较为复杂与繁琐。因此与上述研究相比，本研究结果表明血清MEG3表达是具有较高推广价值的心力衰竭预后的预测指标。

综上所述，老年CHF患者血清MEG3表达与心功能分级呈显著正相关，是患者预后影响因素，且操作简便，可通过积极检测患者血清MEG3表达水平预测患者预后。本研究局限之处在于随访时间尚短，且为单中心研究，另外本研究为回顾性分析，患者检测的生物学标志物可能不全面，有待后续完善。