外周血单个核细胞miRNA-492和miRNA-155水平表达与SNAPPE-Ⅱ评分对儿童急性呼吸窘迫综合征预后价值研究

王庆妹，崔慧娟，杜京辉，庄元华

（1.兖矿新里程总医院，山东邹城 273500；2 .山东大学齐鲁儿童医院，济南 250021）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）发病机制复杂，表现为低顺应性、低氧血症、呼吸窘迫，需要在早期及时进行干预，是重症医学科诊疗的重点难点[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）属于一种非编码RNA，在炎症免疫反应、血管生成、细胞凋亡等过程中发挥作用，能够在不同体液及组织中分离检测，是多种疾病诊断及预后效果评估的生物标志物[2-3]。miR-155和miR-492在自身免疫、胰岛素抵抗、肿瘤发生、调控多种蛋白表达中具有重要作用[4-5]，但是关于ARDS的相关研究却少有报道。急性生理学评分围产期补充（score for neonatal acute physiology perinatal extension，SNAPPE）-Ⅱ评分是一种应用较广的新生儿危重病例评分系统，对新生儿危重症有良好的预测价值。本研究旨在分析血清miR-492和miR-155表达水平与新生儿SNAPPE-Ⅱ对儿童急性呼吸窘迫综合征预后价值，详细报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2019年9月～2020年11月期间兖矿新里程总医院及山东大学齐鲁儿童医院诊治的70例ARDS患儿作为研究对象，并按照预后情况分为死亡组（n=18）及存活组（n=52）；选择同期健康体检儿童36例作为对照组。纳入标准：①符合《急性呼吸窘迫综合征蒙特勒（2017年版）》[6]中的相关诊断标准；②年龄0～12岁；③急性起病，重症监护室机械通气时间≥72 h；④超声心动图检查结果显示无左心房高压。排除标准：①并发其他严重肺部疾病，原发性肺泡表面活性物质缺乏，肺和胸壁畸形及其他严重的先天畸形，肺外严重感染；②先天性代谢紊乱、先天性心脏病等疾病；③临床资料不齐全。本次研究通过医院伦理学会审核（伦理审批号2019934）。

1.2 仪器及试剂 荧光定量仪（ABI美国应用生物系统公司，型号：7300）；PCR 仪（Thermal cycler BIO-RAD，型号：C1000）；制冰机[Scotsman（思科特曼）,型号：AF100]；低温离心机(Labogene，型号：Scanspeed 1730R)；微型振荡器（海门市麒麟医用仪器厂，型号：QL-901）；DEPC（Sigma）；Trizol [ Invitrogen（美国英杰生命技术有限公司）]。

1.3 方法

1.3.1 miR-492和miR-155的检测：受试者入院后次日清晨采集空腹抗凝血，放置于温度为4℃环境中，2 500r/min，离心10min，吸取上层血浆放置于-80℃环境下保存。剩余血细胞依据红细胞裂解法获得白细胞，得到白细胞TRIzol后，将其放置于-80℃环境下保存，采用实时定量PCR检测血浆样本中miR-492和miR-155的表达。miR-492的引物序列为（正向）：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’，（反向）5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；miR-155的 引物序列为（正向）：5’-CCTGCACTCAGGGCTGCCA ACACT-3’，（反向）5’-GGCATCATTGCCGCACGAA TCAGC-3’。每一个反应重复测量三次，然后取平均值，通过血浆外参试剂盒合成展开外参正态化矫正。各个反应体系中信号达到既定阀值的循环数作为Ct值，利用2-ΔΔCt法计算相对表达水平[7]。

1.3.2 临床数据收集：收集受试者的详细临床资料，包括年龄、性别、原发病、病程、血气分析结果、氧合指数（PaO2/FiO2）。检测血细胞检测、肝肾功能、电解质相关指标。ARDS患儿在确诊病情后12h内评估患儿PaO2/FiO2及急性生理年龄与慢性健康（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ）评分[8]，应用SNAPPE-Ⅱ评分对患儿进行评估，评分范围0～162分，分值越高，病情越重[9]。采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测儿童miR-492和miR-155水平。以患儿诊断作为研究起点，患儿死亡或者出院作为研究终点。对比三组儿童PaO2/FiO2，SNAPPE-Ⅱ评分、APACHEⅡ评分、miR-492和miR-155水平。

1.4 统计学分析 应用SPSS 25.0工具进行数据处理，计量资料用均值±标准差（±s）表示，计数资料用例数（比率）[n（%）]表示，分类变量采用卡方检验或t检验方法比较，采用Pearson分析miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ评 分 与PaO2/FiO2，APACHEⅡ评分间的相关性。用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析miR-492和miR-155水平，SNAPPE-Ⅱ评分预测ARDS患儿死亡率的价值，计算ROC曲线下面积（area under curve，AUC），所有测试均为双尾检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般资料比较 见表1。ARDS患儿按照预后情况分为死亡组（n=18）及存活组（n=52），死亡组男性10例，女性8例；年龄1～12（5.35±1.85）岁。存活组男性29例，女性23例；年龄1～12（6.26±1.52）岁。对照组男性19例，女性17例；年龄2～12（5.53±1.35）岁。三组儿童在年龄及性别比较差异无统计学意义（均P＞0.05），ARDS患儿存活组与死亡组乳酸(LAC)、白细胞（WBC）、氧浓度(FiO2)和呼气末气道正压(PEEP)、机械通气时间、潮气量和病程等临床资料比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 ARDS患儿存活组与死亡组一般资料比较（±s）

表1 ARDS患儿存活组与死亡组一般资料比较（±s）

类 别 存活组（n=52） 死亡组（n=18） t/χ2 P年龄（岁） 6.26±1.52 5.35±1.85 0.718 0.108性别（男/女） 29/23 10/8 1.347 0.425 BMI（kg/m2） 26.41±4.65 28.35±5.27 0.373 0.078 LAC（mg/dl） 2.93±0.97 2.92±1.41 0.583 0.074机械通气时间（天） 4.59±2.01 5.66±2.48 2.883 0.583 WBC（×109/L） 12.73±7.85 10.12±5.93 0.421 0.073 FiO2（%） 42.62±7.19 43.41±8.32 1.191 0.235潮气量（ml） 521.67±41.20 539.48±42.56 0.187 0.126 PEEP（cmH2O） 7.75±3.15 8.94±3.63 1.485 0.08病程（天） 6.35±1.29 7.85±1.63 0.482 0.139

2.2 三组儿童PaO2/FiO2，miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ评分和APACHEⅡ评分对比 见表2。对照组与ARDS组患儿比较，PaO2/FiO2，miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ和APACHEⅡ评分差异均有统计学意义（均P＜0.05），ARDS组存活组与死亡组患儿比较，上述指标差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 三组儿童各指标水平对比（±s）

表2 三组儿童各指标水平对比（±s）

项目 对照组（n=36）ARDS组（n=70） χ2 P ARDS存活组（n=52）ARDS死亡组（n=18） χ2 P PaO2/FiO2（mmHg） 448.64±85.54 217.23±29.18 10.373 0.009 269.64±31.53 165.64±27.63 15.962 ＜0.001 APACHE-Ⅱ（分） 5.74±1.42 24.51±4.49 9.472 0.016 20.54±4.29 29.65±5.43 14.924 ＜0.001 miR-155 1.75±0.95 4.31±1.27 12.883 0.003 3.84±0.53 5.64±1.74 9.954 0.023 miR-492 3.75±0.98 7.76±2.08 9.191 0.025 5.63±1.41 9.54±2.25 9.245 0.031 SNAPPE-Ⅱ评分（分） 5.95±1.75 25.75±5.14 10.187 0.006 15.86±3.75 36.45±5.32 16.546 ＜0.001

2.3 三组儿童各指标水平相关性分析 相关性分析结果表明，PaO2/FiO2与miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ评分具有显著负相关性，差异有统计学意义（r=-0.584，-0.623，-0.594，均P＜0.05）；APACHEⅡ评 分 与miR-492，miR-155水 平，SNAPPE-Ⅱ评分呈显著正相关性，差异有统计学意义（r=0.863, 0.868, 0.757, 均P＜0.05），

2.4 各指标预测死亡的价值分析 见表3，图1。对各指标预测死亡率的分析显示，miR-492的敏感度为83.33%，特异度为72.86%，临界值为0.84；miR-155的敏感度为81.53%，特异度为91.43%，临界值为1.43；SNAPPE-Ⅱ评分的敏感度为91.57%，特异度为84.57%，临界值为22.8。miR-492，miR-155与SNAPPE-Ⅱ评分三者联合的敏感度为94.57%，特异度为95.85%，阳性预测值为86.86%，阴性预测值为97.54%，三项指标均对ARDS患儿死亡率有较好的预测作用，且三者联合的诊断效能高于单一指标，说明当miR-492＞0.84，miR-155＞1.43，SNAPPE-Ⅱ评分＞22.8时，ARDS患儿的死亡率较高。

图1 miR-492，miR-155联合SNAPPE-Ⅱ评分的ROC曲线

表3 各指标预测死亡的价值分析

3 讨论

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是由多种肺外致病因素引起的急性炎症性肺损伤，是儿童时期的严重疾病，其标志是肺泡膜通透性改变、肺表面活性剂功能障碍、弥漫性肺间质和肺泡水肿、肺透明膜的形成和肺泡塌陷，可导致患儿死亡[10]，根据流行病学研究，该病的发病率在0.7% ～ 1.6%之间，当并发其他呼吸道疾病时，发病率可增加3 ～4倍[11]。该病的治疗缺少特效方式，主要是液体管理、营养支持、体外膜肺氧合、肺表面活性物质替代、呼吸支持等治疗。既往研究表明，多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）APACHEⅡ评分、休克与ARDS的预后相关[12]。炎症功能障碍和细胞凋亡参与了ARDS的发展，因此细胞因子如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在预测ARDS的预后中也有一定的价值[13]。然而，ARDS的治疗难度仍然较大，具有较高的病死率。因此，研究ARDS发生发展的机制对其防治具有重要意义。

识别新的生物标志物是改善ARDS患儿预后的重要方法，miRNA是小的非编码RNA，可在转录后水平调节基因表达。miRNA可以与靶基因的mRNA配对形成miRNA诱导的沉默复合物，从而降解或抑制靶基因的翻译。多项研究发现，差异表达的miRNA与炎症反应密切相关，在各种急慢性炎症性疾病中发挥着至关重要的作用[14]。miRNA与肿瘤的相关研究已成为医学界的热门话题。随着对miRNA研究的不断深入，多项研究已经证实miRNA参与了ARDS的发生发展，在ARDS患者细胞凋亡及炎症反应中具有一定作用[15-16]。miRNA不仅存在于组织和细胞中，还存在于循环系统中，并且在包括ARDS在内的多种疾病中差异表达，是诊断疾病及评估病情发展的新型生物标志物[17]。最近的一项研究表明，miR-155可以通过Ang-2-Tie-2途径分泌到脓毒症患者的血液中[18]。miR-492位于12q22染色体上，肿瘤分泌的miR-492可以通过激活Toll样受体诱导的炎症反应来调节肿瘤微环境，在转移性肝母细胞瘤、直肠癌、宫颈癌、胰腺癌组织中均可发现其表达上调，与这些肿瘤的发生及转移有关[19]。此外，miR-492还可作为诊断急性心肌梗死的有效生物标志物[20]。

本研究中，三组儿童PaO2/FiO2，miR-492，miR-155，APACHEⅡ和SNAPPE-Ⅱ评分对比差异均有统计学意义。说明血清miR-492和miR-155对ARDS患儿的病情进展具有一定影响，另一项研究表明，miR-155可以作为一种新的生物标志物来预测ARDS 患儿的死亡率和预后[21]，与本研究结果一致。对于miR-492在ARDS中的表达及价值目前尚无报道，丁莹等[22]发现，miR-492可调控单核巨噬细胞系统分泌免疫炎性因子，从而影响支原体肺炎的感染及发病，说明miR-492在急性炎症中存在高表达。PaO2/FiO2，APACHEⅡ评分是一直以来评价ARDS病情的重要指标。本研究相关性分析表明，PaO2/FiO2与miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ评分呈显著负相关；APACHEⅡ评分与miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ评分呈显著正相关。由此进一步说明，miR-492，miR-155表达水平升高与患儿病情严重程度有关，其中的原因有待进一步研究。有研究表明，SNAPPE-Ⅱ评分能够有效预测ARDS患儿的死亡风险，早期进行评分有助于预测病情严重程度并改善预后[23]。本研究ROC曲线分析显示，三项指标均对ARDS患儿死亡率有较好的预测作用，且三者联合的诊断效能高于单一指标，当miR-492＞0.84，miR-155＞1.43，SNAPPE-Ⅱ评分＞22.8时，ARDS患儿的死亡率较高。

综上所述，miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ评分联合检测能够预测ARDS患儿的预后效果，miR-492，miR-155可作为ARDS的潜在标志物。然而，本研究仍然处于初步阶段，样本来源比较单一，今后需要更多大样本多中心临床研究证实miR-492，miR-155在ARDS中的应用价值，使其成为诊断及预测预后效果的新途径。