地中海贫血基因筛查在辅助生殖技术中的应用价值分析

刘居理，陈胜辉，饶研文，邹义兰（南昌市生殖医院，江西 南昌 330004）

近10 年来，我国新生儿出生缺陷率不断攀升，形势非常严峻。出生缺陷不仅会导致新生儿患病、残疾，甚至死亡，严重影响患者生存质量及寿命，还将给家庭及社会带来沉重负担［1］。虽然出生缺陷的致病因素众多且复杂，但遗传因素是一个不容忽视的要素。导致出生缺陷的遗传因素主要包括单基因病、多基因病、染色体数目或结构的异常。单基因病是指单个基因发生突变所引起的遗传病。虽然单基因病发病率较低，但由于病种多，综合发病率高，危害极大。但如果能在孕前了解风险，从而采取针对性预防措施，则可对单基因病的发生起到一个很好的阻断效果。地中海贫血（简称地贫）作为最常见的单基因病之一，是全球最常见的严重临床症状的遗传性疾病［2］，故WHO 推荐对其进行重点防控。地贫由于缺乏理想的治疗手段，一旦患病将造成严重后果。目前公认的首选预防措施是对高风险孕期胎儿进行产前诊断［3］。但产前诊断不可避免地要进行有创操作，从而可能给孕妇及胎儿带来伤害。而在辅助生殖技术中，可通过种植前产前诊断技术对高风险胚胎进行甄别，从而避免异常胚胎的移植，减少对孕妇及胎儿的伤害。

目前，对于普通人群地贫的分子流行病学调查较为常见，但对于采用辅助生殖技术助孕患者的调查研究很少。为进一步了解辅助生殖技术中助孕患者地贫的分子流行病学资料，从而为辅助生殖技术方案的合理选择提供参考，本文对来我院行辅助生殖技术助孕的患者进行了地贫基因携带率和突变类型的分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2021年4月我院收治的2877例拟行辅助生殖技术助孕并在知情自愿的原则下选择做地贫基因检测的患者，年龄22～43岁。

1.2 方法

1.2.1 血液标本采集 利用真空采血法，抽取受检者静脉血2 ml于EDTA抗凝管。

1.2.2 全血基因组DNA提取 采用QIAGEN公司生产的全血基因组DNA 提取试剂盒进行血液基因组DNA的提取，操作步骤按说明书进行。

1.2.3 PCR扩增 采用亚能生物技术（深圳）有限公司生产的α-地中海贫血基因检测试剂盒、非缺失型α-地中海贫血基因突变检测试剂盒及β-地中海贫血基因检测试剂盒分别对α、β-地贫基因进行扩增，扩增条件及程序按说明书进行。

1.2.4 电泳检测 取5 μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用MBI（Fermentas）公司生产的λ DNA/HindIII+EcoRI Markers 作为标准分子量对照。电泳结束后，用凝胶成像系统进行观察，根据Maker大小及对应基因型进行结果评判。

1.2.5 斑点杂交 按非缺失型α-地中海贫血基因突变检测试剂盒及β-地中海贫血基因检测试剂盒提供的方法进行斑点杂交。依据膜条蓝色斑点显现的位置综合判定样本基因型。

2 结果

2.1 地贫基因检出情况 在所检测的2 877例拟行辅助生殖技术助孕患者中，共检出168 例地贫基因携带者，总携带率为5.84%：其中α-地贫基因携带者124 例，携带率为4.31%,占地贫基因携带者总数的73.81%；β-地贫基因携带者38 例,携带率为1.32%，占地贫基因携带者总数的22.62%；α、β 地贫基因双重携带者6 例，携带率为0.21%，占地贫基因携带者总数的3.57%。见表1。

2.2 地贫基因突变类型及其分布 在所检出的携带者中共发现9种α-地贫基因型（见表2）、9种β-地贫基因突变类型（见表3）及4 种αβ 复合型地贫（见表4），其中α-地贫最常见的基因类型为-α3.7/αα,β-地贫最常见的基因突变类型为IVS-II-654。

表3 β-地贫基因突变类型及分布

表4 αβ复合型地贫基因类型及分布

3 讨论

遗传性疾病是引起胚胎流产以及新生儿死亡的主要原因之一，对个体的生存及生活质量都会产生很大影响［4］。地贫作为我国南方地区最常见的遗传性疾病之一，给社会及家庭带来了巨大的危害［5］。其致病机制为：由于珠蛋白基因的缺陷，使珠蛋白链合成减少或缺失，导致血红蛋白结构改变，红细胞寿命缩短，从而引起溶血性贫血［6］。地贫属于常染色体隐性遗传病，亚型众多，其中α和β地贫最为多见。α-地贫是世界上最为常见的单基因遗传病，其分子基础是位于16 号染色体末端16P13.3 位点的α 珠蛋白基因缺陷。β-地贫也是世界上最为常见的单基因遗传病之一，其在我国的分布与α-地贫类似，其分子基础是位于11 号染色体末端11P15.3 位点的β 珠蛋白基因缺陷。根据基因缺陷的方式不同，α-地贫可以分为缺失型和非缺失型两类。目前我国已鉴定出8 种缺失型和7 种非缺失型α-地贫，其中常见的缺失型是--SEA、-α3.7及-α4.2，非缺失型是ααWS、ααQS及ααCS。与α-地贫不同的是，β-地贫主要是由于基因突变导致，目前我国已发现34 种突变，其中CD41-42、IVS-II-654、CD17、-28、CD26及CD71-72突变为优势基因，占90%以上［7］。

目前临床上对地贫基因筛查普遍采用的方法是：利用跨越断裂点PCR(Gap-PCR)技术检测地贫基因片段的缺失，利用反向点杂交(RDB)技术检测地贫基因的点突变［8-9］。本文分别采用Gap-PCR 及RDB技术对来我院生殖中心就诊的拟行辅助生殖技术助孕患者进行了地贫基因筛查。根据地贫基因在我国的分布情况，本文选择了最为常见的3种缺失型α-地贫（-SEA、-α3.7和-α4.2α）、3 种突变型α-地贫（ααWS、ααQS和ααCS）及17 种突变型β-地贫（IVS-II-654、CD41-42、CD17、CAP+40-43、 CD31、CD43、CD71-72、-28、-29、βE、-32、-30、CD14-15、IVS-I-5、CD27-28、Int、IVS-I-1）作为筛查目标。结果显示：在所检测的2877例拟行辅助生殖技术助孕患者中，地贫基因总携带率为5.84%。其中：α-地贫基因携带率为4.31%,占地贫基因携带者总数的73.81%；β-地贫基因携带率为1.32%，占地贫基因携带者总数的22.62%；α、β 地贫基因双重携带率为0.21%，占地贫基因携带者总数的3.57%。以上结果提示：（1）来我院拟行辅助生殖技术助孕患者人群中地贫基因携带率较高，其携带率虽然比两广及海南等地贫高发区稍低，但和其它地区如重庆、四川、贵州等比要高；（2）我院筛查的地贫基因携带者中以α-地贫为主，而α-地贫基因携带者通过血液常规分析往往很难发现异常，更容易遭到忽视，因此存在较大风险。另外，在本文所检出的地贫携带者中共发现9 种α-地贫基因型、9 种β-地贫基因突变类型及4 种αβ 复合型地贫，其中α-地贫最常见的基因类型为-α3.7/αα，β-地贫最常见的基因突变类型为IVS-II-654。这与地贫基因在我国的分布情况也是相符合的。

由于静止型及轻型地贫可无任何临床表现，因此其致病风险很容易被人忽视，但一旦患病，特别是中重型地贫患者，则可致残甚至致死，且目前尚无有效的治疗方法［10］。因此，大规模筛查突变基因携带者，阻止中重型地贫患儿出生是最必要的有效措施［11］。近年来，我国对于地贫的防控工作越来越重视，地贫防控项目正在南方多省份实施。地贫难治但可防，婚前、孕前及产前检查是有效防控地贫的首要措施和重要策略［12］。如胎儿存在地贫风险，可采用产前诊断技术加以避免，但存在创伤风险。而在辅助生殖技术过程中，可采用胚胎植入前诊断技术加以避免，则风险很小。随着不孕症发病率的增加和辅助生殖技术的发展，通过辅助生殖技术出生的人群在社会总人口中占比不断增大［13］。但目前关于辅助生殖技术助孕人群的地贫资料极少，因此有必要分析地贫在该人群中的分布情况，社会意义重大。本文调查结果显示：在行辅助生殖技术助孕的人群中，地贫基因携带率较高，应该引起生殖医学工作者的重视。为了避免地贫后代的出生，在辅助生殖技术过程中有必要对夫妻其中一方进行地贫基因检测，并根据检测结果决定是否对夫妻另一方进行地贫基因的检测。如存在生育地贫患儿的可能，则可通过胚胎植入前产前诊断技术加以避免，以利于优生。