研究人自体PBMC 宫腔灌注对反复种植失败患者FET妊娠结局的影响*

李洁，杨丽娟，刘居理，黄玉芳，胥杜娟,胡硕楠，薛洁（南昌市生殖医院，江西 南昌 330001）

体外受精-胚胎移植（IVF-ET）及其衍生技术目前已成为治疗不孕症患者最常见的助孕方式［1］，随着该项技术水平的不断提高，IVF-ET 的单个周期胚胎移植成功率已达60%左右，但依然有40%的病人不能达到良好的妊娠结局，甚至有的患者多个周期移植多个优质胚胎依然未成功妊娠，称为胚胎反复种植失败（RIF），发生率大约为5%～10%，是生殖领域困扰医生的一大难题［2］。Yoshioka［3］等尝试采用将人自体PBMC 灌注到宫腔的方法来治疗反复种植失败患者，认为该方法可以显著提高反复种植失败患者再次移植的临床妊娠率和着床率。本论文采取随机对照的方法研究移植前宫腔灌注人自体PBMC 对反复种植失败患者FET 妊娠结局的影响。报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2019 年6 月至2021 年12 月来我院收治的RIF 患者80例，以简单随机法分为试验组和对照组各40 例。RIF的诊断标准：移植≧2次或累计移植≧10 枚胚胎但未能获得临床妊娠。纳入标准：（1）夫妇双方染色体核型均正常；（2）女方血清卵泡刺激素＜15IU／L；（3）女方年龄＜40 岁；（4）女方的免疫抗体未见异常；（5）无输卵管积水或者异常输卵管积水已结扎；（6）宫腔镜检查未见异常；（7）本中心冷冻有1个或以上胚胎。排除标准：（1）子宫器质性病变；（22）子宫内膜异位症等；（3）多囊卵巢综合征、甲状腺功能异常、高泌乳素血症等内分泌疾病。本研究经我院医学伦理委员会审核批准。所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 PBMC 的提取 在胚胎移植前抽取患者外周血4 ml，加入肝素抗凝，静置30 min 后取上清液，将上清液从15 ml 离心管边缘轻轻加于含4 ml Ficoll分离液（美德太平洋（天津）生物科技公司，津械备20160177 号）上面后离心20 min（1 800 r/min），离心后取白膜层，加入0.9%生理盐水再次离心5 min，洗涤3次。用0.9%生理盐水调整细胞浓度为2×106/ml，放置于孵育箱培养待用。

1.2.2 冻融胚胎移植

1.2.2.1 降调后人工周期/直接人工周期准备内膜月经期皮下注射亮丙瑞林（北京博恩特药业，国药准字号H20093809），28～30 天后口服戊酸雌二醇片（拜耳医药，国药准字号J20171038）或芬吗通雌二醇片（康德乐（上海）医药，国药准字号H20150345）做内膜准备，或者月经期不注射降调药物，直接口服芬吗通雌二醇片或戊酸雌二醇片，当内膜厚度达到8 mm 及以上时，肌肉注射黄体酮注射液（浙江仙琚制药，国药准字号H33020828）转化内膜，内膜转化第4天移植1～2枚卵裂胚，或第6天移植1～2 枚囊胚。

1.2.2.2 自然周期/促排卵周期准备内膜 在我院监测卵泡发育，待卵泡破裂后第4 天移植1～2 枚卵裂胚，或第6天移植1～2枚囊胚。

1.2.2.3 干预方法 试验组在卵泡破裂当日或口服雌激素内膜达到8 mm 及以上进行孕酮转化当日抽取患者自身的外周血4 ml，提取PBMC，于移植前1天、3天将PBMC用人工授精管轻轻注入宫腔内，适时移植胚胎，移植后第10天抽血测量β-人绒毛膜促性腺激素（hCG）水平，若β-HCG＞8 mIU/ml 则为生化妊娠，移植后28～30 天行超声检查，宫内见孕囊、胎芽及心管搏动则为临床妊娠。对照组则在同等时间进行生理盐水的宫腔灌注。

1.3 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件对所有数据进行统计分析。两组间进行均数的比较采用t检验；计数资料则用率表示，使用χ2检验进行分析。P＜0.05示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 试验组和对照组患者的一般情况比较 对试验组和对照组患者的一般情况包括女性的年龄、原发不孕率、不孕的年限及体重指数进行比较，差异上无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组患者一般情况的比较

表2 两组患者行FET妊娠结局的比较

2.2 试验组和对照组患者行FET 妊娠结局的比较对两组患者的子宫内膜厚度、A 型子宫内膜比率、移植胚胎个数、流产率及异位妊娠率进行比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），对两组患者的胚胎种植率和临床妊娠率进行比较，试验组的胚胎种植率和临床妊娠率高于对照组，差异上具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

近年来，不孕症患者人数不断上升，辅助生殖手段逐渐被社会所认知和接受，IVF-ET使很多患者获得后代，但依然有一部分患者会出现反复妊娠失败（RIF）的情况，给患者带来了很大的经济负担［4］。如何提高胚胎着床率和胚胎质量是该领域主要研究目标［5］。对于RIF 的解释提出了许多假说，其中之一是对植入和免疫生理方面的探索［6-8］，免疫学认为妊娠是一种类似于同种异体移植的现象，在着床前和着床过程中，淋巴细胞通过分泌细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附分子等，在子宫内膜和胚胎之间建立了一种丰富复杂、尚未阐明的交叉对话，帮助胚胎着床。其中子宫NKs(uNKs)是母体胎儿界面最具代表性的免疫细胞，占所有蜕膜白细胞的50%～90%，uNKs 可通过血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PLGF)、白血病抑制因子(LIF)和干扰素(IFN)控制子宫内膜蜕膜形成和血管形成［9］，多项研究均表明其可成为预测IVF 成功率的一个良好指标［10］。此外有研究表明，母体免疫系统似乎通过Th1/Th2细胞因子的平衡参与妊娠的建立和维持［11］。这两种系统之间的不平衡可以解释某些患者植入失败的原因。

本研究采用随机对照的方式，将80 例RIF 患者随机分为试验组和对照组，试验组尝试提取患者自身外周血PBMC细胞，在胚胎移植前1，3天进行宫腔灌注，而对照组则只在同一时间段灌注生理盐水，这种设计排除了宫腔刺激对妊娠结局的影响，使得结果更加可信，结果显示：两组患者的一般情况如年龄、原发不孕比率、不孕年限、体重指数均未见明显差异。两组患者FET 周期的子宫内膜厚度、A 型子宫内膜比率、移植胚胎个数、流产率和异位妊娠率均未见明显差异，但两组患者FET周期的胚胎种植率、临床妊娠率相比较，差异有统计学意义，试验组的胚胎种植率为49.27%，而对照组的胚胎种植率仅30.88%，试验组的临床妊娠率达62.50%，而对照组的临床妊娠率仅40.00%，这与部分研究者的结果一致［12］，表明PBMC宫腔灌注可改善RIF患者的妊娠结局，而这可能的机制是PBMC 包括单核淋巴细胞、T淋巴细胞以及B 淋巴细胞等免疫细胞，而这些免疫细胞可能通过分泌免疫细胞因子从而在胚胎着床过程中发挥重要作用［13］。

综上，RIF 患者移植前进行自体PBMC 宫腔灌注可显著提高FET 周期的胚胎种植率和临床妊娠率，同时不增加流产率及异位妊娠率,因该项操作简便，患者创伤性小，同时使用的是自体PBMC 细胞，不存在伦理的争议，是可以推广使用的一种治疗方法。