艾司氯胺酮对大鼠骨折愈合的影响

屈 博，马智聪，李玉斐，乔心怡

(1 山西医科大学麻醉学院附属第二医院麻醉教研室，太原 030001；2 山西医科大学第二临床医学院麻醉科；*通讯作者,E-mail:2646610349@qq.com)

骨折愈合过程需要许多不同种类的生物因子发挥作用，其中关于神经系统在骨质形成和骨折愈合过程中起到的重要作用获得了越来越多的关注[1,2]。艾司氯胺酮作为骨折愈合术后常用的镇痛药物之一，能够迅速通过血脑屏障；虽为氯胺酮的旋光异构体，却不同于氯胺酮具有时间和剂量依赖性的神经毒性[3]，其不良反应大大减少[4]。除给予手术过程必要的麻醉镇痛支持外，还能够通过作用于神经系统进而影响相关神经因子的合成及释放[5]，但其对骨折愈合过程能否产生影响尚不明确。本研究通过对大鼠胫骨骨折模型行艾司氯胺酮腹腔注射处理1，2，4周后，对BDNF、VEGF及离体胫骨BMP-2及切片情况进行分析，观察艾司氯胺酮对大鼠骨折愈合的影响，进而探索其在骨折愈合中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验样本

本研究经本院医学伦理研究委员会审查并批准。实验所用雄性SD大鼠来自山西医科大学动物中心，体质量(200 ±20)g。所用药品为艾司氯胺酮(规格：50 mg/2 ml，批号：200411BL，江苏恒瑞医药股份有限公司)。排除标准：①骨折处未形成横形骨折；②大鼠在骨折模型完成后的饲养过程中出现感染等特殊情况；③骨折模型制作过程中克氏针位置出现偏移；④饲养过程中出现明显异常变化(如：体质量异常改变等)；⑤实验大鼠因各种原因在实验过程中死亡(处死步骤除外)。采用随机数字表法将大鼠均匀分为KET组和空白组，每组24只。

1.2 主要仪器

白洋G20型台式高速离心机、Rayto RT6100酶标分析仪等。

1.3 主要试剂

脑源性神经营养因子ELISA检测试剂盒、血管内皮生长因子ELISA检测试剂盒来自上海江莱生物科技有限公司，PV6000通用型试剂盒、ZLI-9066免疫组化抗原修复缓冲液、ZLI-9018 DAB显色试剂盒、ZLI-9029抗体稀释液来自北京中杉金桥生物技术有限公司，Bs-1012R Rabbit Anti-BMP2 antibody来自北京博奥森生物技术有限公司。

1.4 实验方法

实验大鼠在行胫骨骨折模型前均给予3 d适应性饲养，控制体质量在(200 ±20)g，行7%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，仰卧位四肢固定置于造模支架上，于造模工具台下方仰卧位固定大鼠四肢，右侧胫骨备皮后置于嵌合器中，应用2.5 kg砝码自中央柱15 cm高度自由下落撞击嵌合器致大鼠右侧胫骨骨折，在骨折处沿与胫骨长轴平行方向开长度适宜的纵形切口，确定骨折类型为横形骨折后，应用1.0 mm克氏针对大鼠行切开复位内固定术，术后继续在术前相同条件下饲养。自模型制成后第1日起，给予KET组大鼠每日两次(8 ∶00和20 ∶00)腹腔注射艾司氯胺酮(40 mg/kg)，药物注射持续整个实验过程(大鼠处死前一日最后两次注射)。空白组给予相同剂量0.9% NaCl溶液，注射方式、注射时间点以及持续时长同KET组。在模型制成后1，2，4周时分别从两组中随机选8只大鼠行右侧颈动脉取血，留取所需血液样本量后，保持大鼠麻醉状态下应用急性失血法对大鼠实施处死，完成后保留右侧胫骨行脱钙处理。

1.5 观察指标

1.5.1 BDNF、VEGF的含量测定 于1，2，4周时间点，分别从KET组和空白组随机选取8只大鼠取右侧颈动脉血5 ml，离心20 min后应用ELISA法分别检测血清中BDNF、VEGF含量。

1.5.2 离体胫骨骨折处骨痂切片及BMP-2水平 上述大鼠取颈动脉血后处死，将大鼠骨折肢体做离体处理，经脱钙60 d处理后，行骨折部位切片处理，对比两组骨折大鼠骨折处免疫组化染色情况及BMP-2水平。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 两组大鼠饲养期间体质量变化比较

比较两组大鼠骨折模型制成后饲养期间体质量变化，在各时间点上两组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.2 两组大鼠BDNF含量的变化情况

各时间点KET组血清中BDNF含量均高于空白组(P<0.05)；两组组内血清中BDNF含量随时间变化呈逐渐升高趋势，且组内差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 两组大鼠各时间点血清中BDNF含量对比Table 2 Comparison of serum BDNF content at different time points between two

2.3 两组大鼠VEGF含量的比较

各时间点KET组血清中VEGF含量高于空白组(P<0.05)；两组组内血清中VEGF含量均随时间变化呈逐渐增高趋势，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

表3 两组大鼠各时间点血清中VEGF含量对比Table 3 Comparison of VEGF content in serum at diffe-rent time points between two

2.4 两组大鼠离体胫骨BMP-2对比

不同时间点KET组离体胫骨BMP-2水平较空白组高(P<0.05)；两组组内离体胫骨BMP-2水平随时间变化均呈升高趋势，且差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。

表4 两组大鼠离体胫骨免疫组化图像分析(面积积分光密度)对比Table 4 Comparison of immunohistochemical image analysis(area integral optical density) of isolated tibia of rats between two

2.5 两组离体胫骨骨折处免疫组化对比

两组大鼠骨折处BMP-2阳性表达数量随时间变化均增加，且相同时间点上KET组骨折处染色质量优于空白组(见图1)。

箭头所示为BMP-2阳性定位图1 两组离体胫骨骨折处免疫组化染色对比 (SP，×400)Figure 1 Comparison of immunohistochemical staining of tibial fractures in vitro between the two groups (SP,×400)

3 讨论

骨折愈合的整体过程是通过机体应激反应、生长因子支持、相关激素调节等多种因素共同介导[6]。其中神经因素，尤其是经由脑部发起的神经、体液调节途径与骨代谢之间的相互作用尤为突出[7,8]。艾司氯胺酮作为能够迅速通过血脑屏障的静脉麻醉药，可作用于机体神经系统，进而影响机体相关因子的产生和释放[9]。在本研究中发现，应用艾司氯胺酮能使骨折模型大鼠血清的BDNF、VEGF水平升高，同时上调离体胫骨骨折处BMP-2表达水平。

BDNF是一种主要存在于中枢神经系统、具有营养神经作用的蛋白质。作为调节神经细胞功能的重要因子之一，BDNF与其受体在骨痂中的表达贯穿了整个骨折愈合过程，特别是炎症反应阶段及成骨阶段[10]。Asaumi等[11]研究发现，在小鼠骨折模型中，BDNF mRNA在骨折后逐渐升高，另有成纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞等同神经细胞一样分泌并释放BDNF。Li等[12]发现在应用BDNF后，人骨髓间充质干细胞数量增加，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化，同时成骨基因和血管生成基因的相对mRNA表达量均增加。另外，一项针对大鼠胫骨骨折模型实施皮下注射BDNF的研究发现，相较于注射同等剂量生理盐水，BDNF组骨折愈合的速度更快、质量更高[13]。说明BDNF升高能够促进骨折愈合。另有研究[14]发现阻断N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂能够通过抑制中间能神经元处受体，促进谷氨酸释放，引起BDNF组蛋白乙酰化，改变BDNF结构，进而提升BDNF蛋白表达水平。结合本研究中两组大鼠BDNF水平实验结果，我们认为艾司氯胺酮可能通过抑制相应受体，促进大鼠BDNF蛋白结构改变，进而增加BDNF的表达。

VEGF能够促进血管内皮细胞生成，增加血管通透性、加快血管内皮细胞增殖以及血管形成等作用。研究表明，血管内皮生长因子可加速骨折伴颅脑损伤患者骨折愈合[15]。同时VEGF具有增强骨形态发生蛋白诱导骨形成的潜力[16]；这一理论在Tobiume等[17]通过应用预制含有VEGF胶原复合物的血管完成同种异体骨移植的研究中得到印证。另有研究表明注射载VEGF微球水凝胶复合材料用于股骨头坏死的血管化和骨再生同时可以促进新骨的形成[18]，提示VEGF能够在一定程度上加速骨折愈合的进程。在本研究中，两组结果对比后发现艾司氯胺酮能够促进VEGF水平的升高。另结合氯胺酮刺激VEGF释放的相关机制研究[19]，认为艾司氯胺酮可通过阻断NMDA受体致谷氨酸短暂释放，兴奋α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体,进而激动Ⅰ型电压门控钙通道致钙离子内流，最终上调机体内VEGF水平。

BMP-2是具有骨诱导性的骨形态发生蛋白，能够促进成骨细胞生成，还能诱导机体骨和软骨形成。Bai等[20]已经证明BMP-2能够通过上调相关蛋白、因子来诱导BDNF的生成和分泌。Al-Hijazi等[21]在针对骨质疏松大鼠骨修复的实验中发现，BMP-2和BDNF二者联合应用时，能够促进骨质疏松大鼠的骨修复。说明BDNF与BMP-2在促进骨折修复方面就有一定协同作用。另有研究表明，在骨重建过程中，应用特定药物释放模式持续释放VEGF和BMP-2能够促进血管生成和成骨能力[22]，同时根据Kim等[23]应用海藻酸微珠持续释放BMP-2明确增强了兔胫骨干骺缺损模型的骨质再生的研究，认为在骨折愈合的过程中，BMP-2、VEGF在发挥各自作用时，能够同向促进骨折愈合进展。在本研究中，相较空白组，KET组离体胫骨BMP-2水平明显升高，结合骨折部位切片中KET组骨折离体胫骨免疫组化结果优于空白组，提示艾司氯胺酮能够促进模型大鼠骨折愈合进行，并能够上调BMP-2水平。另外，Wang等[24]在处理大鼠尿路上皮细胞时发现使用氯胺酮可促进转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达，而TGF-β1通路以过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)为连接点，与BMP-2通路实现协同作用，进而增加BMP-2表达[25]。提示艾司氯胺酮可能通过增加TGF-β1表达，激活该因子通路，并通过PPARγ与BMP-2通路耦联，上调BMP-2表达，进而使得骨折处BMP-2水平升高。

本研究也存在一定的局限性：首先，实验中未能对大鼠体内血药浓度变化行实时监测，仅通过固定时间点注射不能确定维持机体有效血药浓度的最佳给药时机；第二，可以进一步通过增加检测手段(如X线片)及检测骨密度等指标综合分析模型大鼠骨折愈合情况；第三，就本实验而言，对比不同剂量或不同骨折类型条件下艾司氯胺酮能否产生类似作用，以及针对艾司氯胺酮影响大鼠骨折愈合的具体机制还需要进一步实施大样本、多角度的系统实验进行补充，以期为艾司氯胺酮的进一步临床应用提供更详细的理论依据。

综上所述，本实验通过对比KET组和空白组BDNF、VEGF的含量变化，以及比较分析了上述两组离体胫骨免疫组化结果后发现，艾司氯胺酮能够对模型大鼠的骨折愈合过程产生促进作用，其机制可能与艾司氯胺酮促进骨折大鼠体内BDNF、VEGF以及BMP-2含量水平升高有关。