CLOCK基因多态性与脑卒中后静脉血栓形成的关系

王霞 李美 张文奇 (衡水市人民医院(哈励逊国际和平医院) 康复医学科，河北 衡水 053000)

静脉血栓形成是导致脑血管狭窄、闭塞和远端血流减少的主要原因。特别是脑动脉粥样硬化性狭窄被认为是脑梗死的独立危险因素，可导致缺血性脑卒中〔1〕。研究表明，缺血性脑卒中的发病率随着脑动脉内膜中层厚度(IMT)的增加而升高，脑动脉IMT的增加直接反映了动脉粥样硬化的程度〔2〕。另外，脑动脉粥样硬化易损斑块在脑梗死中起着重要作用〔3〕。

近年来，人们的注意力主要集中在昼夜节律钟的基因上，这是一系列参与维持不同器官系统内部和之间的内部协调基因，以提高生物体的体质，并对周期性环境事件(如昼夜循环)作出最有效的反应〔4〕。昼夜运动时钟基因(CLOCK)基因是这方面研究的第一批基因之一，它编码时钟蛋白，是昼夜系统的调整蛋白〔5〕。昼夜节律是复杂生物学系统，它的改变，如轮班工作、睡眠剥夺、夜间强光照射及衰老的生理过程或时钟基因的遗传变异，都与一些生理和病理条件有关。特别是，CLOCK的变异与肥胖、2型糖尿病、睡眠和情绪障碍及不同类型癌症的风险存在相关〔6〕。目前，CLOCK基因多态性在脑卒中后静脉血栓形成的相关性尚不清楚。本研究拟筛选脑卒中后静脉血栓患者外周血中CLOCK基因多态性，研究其与脑卒中后静脉血栓形成的相关性，为脑卒中后静脉血栓患者的早期发现和早期治疗提供新的生物标志物,探讨CLOCK基因多态性对脑卒中后静脉血栓形成早期诊断、判断预后的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年1月至2018年7月在衡水市人民医院诊治的脑卒中患者344例为脑卒中组，其中男212例，女132例，年龄57～73〔平均(66.34±2.13)〕岁。根据超声检查是否有静脉血栓，将其分为未伴静脉血栓组和伴静脉血栓组。根据斑块稳定性又分为稳定斑块组和不稳定斑块组。静脉血栓超声诊断标准：(1)静脉血管内存在强弱不等的实质性回声；(2)加压状态下静脉血管难以被压瘪或仅部分被压瘪；(3)多普勒超声血流显像不能探及血流或超声显示血流充盈缺损；(4)静脉血管内径增宽。斑块的诊断标准包括：①IMT>1.3 mm或比邻近部位厚0.5 mm，或IMT为邻近部位的1.5倍；②彩色图像显示增厚内膜向血管腔内凸出。根据超声表现分为扁平斑块、软斑块、硬斑块和溃疡斑块。根据斑块回声和回声水平，扁平斑块和硬斑块被认为是稳定的，而软斑块、溃疡斑块和各种混合斑块被认为是不稳定的(脆弱的)。本研究以占据动脉管>75%为大型斑块。脑梗死诊断标准符合2007年《中国脑血管病防治指南》〔7〕。如果受试者患有自身免疫性疾病、全身炎症性疾病、癌症、风湿性心脏病、肌肉骨骼疾病、甲状腺疾病、肝肾功能异常，外伤史，研究期间接受手术则被排除在外。收集同期169例健康志愿者作为对照(正常组)，其中男98例，女71例，年龄50～75〔平均(62.37±3.01)〕岁，两组对比一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。受试者均给予书面知情同意。

1.2数据收集 所有受试者都有详细的既往病史、个人史、家族史和缺血性脑卒中史。高血压诊断为收缩压>140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒张压>90 mmHg；空腹血糖>7.0 mmol/L或随机血糖>11.1 mmol/L伴有典型糖尿病症状者诊断为糖尿病；有典型病史或经心电图、超声心动图证实者为冠心病。吸烟者被定义为吸烟累计超过5年或戒烟不超过5年。

1.3血样采集 抽取受试者4 ml空腹肘静脉血，用于分离血清。在ADVIA2400全自动生化分析仪上用生化比色法测定总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)和葡萄糖。正常参考值TC<5.2 mmol/L，TG<1.7 mmol/L，葡萄糖<3.96.1 mmol/L。

1.4脑动脉B超检查 采用美国通用电气公司的Vivid 7型彩色多普勒超声诊断仪的10 mHz线探头，由专业人员对脑动脉进行垂直和水平二维B超扫描。将受试者置于仰卧位，头部略微向后，以充分暴露脑部的检查侧。获得了包括IMT在内的技术数据。斑块形成定义为脑动脉IMT>1.0 mm。质地回声强于周围组织，表面光滑的斑块被定义为硬斑块，视为稳定斑块；质地回声弱于周围组织，表面回声低的斑块被定义为软斑块。脑动脉IMT在1.0～1.3 mm为脑动脉粥样硬化，大于1.3 mm为脑动脉斑块。

1.5qPCR检测 使用TRIzol试剂盒从血清中提取总RNA，并使用mRNA分离试剂盒分离mRNA。用反转录试剂盒(TaKaRa)转录成cDNAs。定量实时聚合酶链反应用qRT-PCR试剂盒(TaKaRa)进行。程序设置如下：95℃持续1 min；35个循环，95℃持续15 s，60℃持续15 s，72℃持续30 s；最后95℃、65℃和30℃各持续1 min。采用ABI-PRISM 7900HT RT-PCR系统，进行检测，用2-ΔΔCt法检测相关基因表达水平。引物序列:CC正义链:5'-TAGATGGTGTCCTCCAAACTGCTT-3'，反义链5'-GTTTTTAATAGCTGAGTAGTATTCCATTGT-3'；CG正义链：5'-TAGATGGTGTCCTGCAAACTGCTT-3'，反义链5'-GTTTTTAATAGCTGAGTAGTATTCCATTGT-3'；GG正义链:5'-GTTTTTTGACTTTTAAGAGTCT-3'，反义链5'-TCAGTTTATCCATTTGCCCCAAGG-3'。

1.6生存率研究 总生存率为研究终点，为手术至死亡或最近的随访时间。每个月通过门诊或是电话随访患者。

1.7统计学方法 采用SPSS13.0软件进行t检验、单因素方差分析、χ2检验。

2 结 果

2.1CLOCK rs4580704 C基因突变成G基因(C>G)基因型在正常组和脑卒中组的差异 正常组CLOCK rs4580704 GG基因型高于脑卒中组，CG低于脑卒中组，差异具有统计学意义(P<0.05)。正常组CLOCK rs4580704 CC及CG+GG比例与脑卒中组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 CLOCK rs4580704 C>G基因型在 正常组和脑卒中组的差异〔n(%)〕

2.2脑卒中组不同基因型一般资料比较 各组的年龄、体重、腰围、吸烟、体重指数(BMI)、TC、TG、低密度脂蛋白、高血压、糖尿病和冠心病，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 脑卒中不同基因型组一般情况比较

2.3CLOCK rs4580704不同基因型脑卒中生存率比较 CLOCK rs4580704 CC组的生存率(73.2%)显著高于CG组(70.1%)，但显著低于CG+GG组(81.0%)和GG组(90.5%，均P<0.05)。见图1。

图1 CLOCK rs4580704不同基因型对脑卒中生存率的影响

2.4CLOCK rs4580704在脑卒伴静脉血栓患者的相关性 与未伴静脉血栓组比较，伴静脉血栓组中CLOCK rs4580704 CC及CG比例显著上升，CLOCK rs4580704 CG+GG及GG比例显著下降(P<0.05)。见表3。

表3 脑卒中伴静脉血栓组与脑卒中组基因型比较〔n(%)〕

2.5CLOCK rs4580704不同基因型对脑卒中伴静脉血栓患者生存率的影响 脑卒中伴静脉血栓患者CLOCK rs4580704 CC组生存率(70.24%)显著高于CG组(68.40%)，显著低于CG+GG组(77.60%)及GG组(86.18%，P<0.05)。见图2。

2.6稳定斑块与不稳定斑块组CLOCK rs4580704基因型比较 稳定斑块组与稳定斑块组比较，不稳定斑块组中CLOCK rs4580704 CC比例显著下降，CLOCK rs4580704 CG和CG+GG比例显著上升(P<0.05)。见表4。

2.7不同斑块体积CLOCK rs4580704基因型比较 与大型斑块组比较，小型斑块组中CLOCK rs4580704 CC和GG比例显著下降，CLOCK rs4580704CG和CG+GG比例显著上升(P<0.01)。见表5。

图2 CLOCKrs4580704不同基因型对脑卒中伴 静脉血栓患者生存率的影响

表4 稳定斑块与不稳定斑块组CLOCK rs4580704 基因型比较〔n(%)〕

表5 不同斑块体积CLOCK rs4580704基因型比较〔n(%)〕

3 讨 论

动脉粥样硬化是导致脑动脉狭窄或闭塞、缺血性脑卒中的主要原因，在世界范围内发病率和死亡率都很高〔1,8〕。缺血性脑卒中占所有脑卒中的60%～80%〔9〕。有证据表明，脑动脉IMT和斑块在很大程度上受基因控制，这两种基因分别导致30%～60% IMT和约28%的斑块增加〔10〕。

窦静脉血栓形成的基础可能与Virchow的三联征有关，包括血管壁损伤、高凝状态和淤滞〔11〕。到目前为止，已知的血栓形成的易感危险因素包括炎症，而感染除了增加颅内静脉窦血栓形成(CVST)的风险外，还可能增加患者血栓形成的风险〔12〕。感染期间特异性地导致血栓形成的病理生理机制尚未完全阐明，但炎症已被视为高凝状态的原因之一，炎症在脑卒中中也起着重要作用〔11〕。本研究发现，CLOCK rs4580704 CC可能参与脑卒中疾病的发生发展，但机制尚不明确。

自发性(非创伤性)脑出血引起的脑卒中是由于脑动脉或小动脉破裂后血液外渗到脑实质引起的。全球疾病负担研究估计，2010年全世界共发生532万例(首次)出血性脑卒中(即脑出血和蛛网膜下腔出血)，导致每10万人年发生82例，高血压是脑出血的最大危险因素，人群归因风险约为50%〔1,8〕。近几十年来，脑出血时抗血栓(抗血小板或抗凝剂)药物的使用率已上升至约50%。基于人群的病例对照研究报告称，在脑出血患者中，约20%服用抗凝剂，30%在症状出现时服用抗血小板药物，而在无脑出血患者中，约6%服用抗凝剂，约23%服用抗血小板药物〔13〕。本研究结果显示，CLOCK rs4580704 CC参与脑卒中患者静脉血栓的形成。

脑出血的幸存者有复发脑出血的风险，特别是如果不治疗脑出血的潜在原因(如高血压、动静脉畸形)，同时也有缺血性脑卒中、缺血性心脏病、房颤和全身性栓塞的风险〔14〕。有研究比较了脑出血后脑内不同部位的预后，其中两项发现大叶性脑出血后复发的风险高于深部脑出血〔12〕。一些患者的磁共振成像(MRI)中发现脑微出血是复发性缺血性脑卒中和脑出血风险较高的生物标志物〔12〕。本研究结果证明，CLOCK rs4580704 CG+GG可能抑制脑卒中患者静脉血栓的形成。

内源性昼夜节律计时系统包括下丘脑的视交叉上核(SNC)及不同器官的外周周期振荡。核心分子由一个转录-翻译-反馈环组成，该环以24 h的节律振荡〔15〕。几个核心时钟基因参与了这个系统的调节。其中，昼夜运动输出周期(Kaput)基因是一种转录因子，来自与大脑和肌肉ARNT-Like(BMAL1)形成复合物的分子时钟。在小鼠模型中，CLOCK突变首先与葡萄糖稳态相关，然后与肥胖、高血糖和高胰岛素血症相关〔16〕。CLOCK rs4580704 C>G是与其他蛋白连锁，产生调控作用〔16〕。降脂药物和饮食网络人群遗传学的工作中，观察到携带CLOCK rs4580704的次要等位基因(G)的携带者具有较低的体重、空腹胰岛素和高血糖风险〔17〕。 此外，研究发现，CLOCK rs4580704和单不饱和脂肪酸摄入量之间的基因相互作用，以确定CLOCK的空腹血糖和胰岛素抵抗。当不饱和脂肪酸摄入量较低时，这些CLOCK表达没有差异〔18〕。然而，当不饱和脂肪酸摄入量较高时，少数等位基因携带者的血糖水平明显较低。研究认为，这种CLOCK rs4580704可能与调节胰岛素抵抗风险有关〔18〕。Corella等〔19〕研究发现，在2型糖尿病患者中，CLOCK基因变异与2型糖尿病和心血管疾病的发病率相关。本研究发现，CLOCK rs4580704 CG+GG可以减少静脉血栓斑块的稳定性。

昼夜节律基因通过转录和翻译反馈环控制mRNA的周期转录和蛋白质合成。电压门控钠离子通道(SCN)中含有一些必需的蛋白质。激活因子是CLOCK和芳香烃受体核转运体样(ARNTL)，而转录抑制剂是周期基因(PER)和隐花色素(CRY)蛋白〔18〕。Tracey等〔20〕研究发现，CLOCK基因调控小板生成素与表达。 本研究发现，CLOCK rs4580704 CG+GG可以减少斑块体积，参与静脉血栓的形成。

综上，CLOCK rs4580704 CG+GG可能抑制脑卒中患者静脉血栓的形成，可能作为临床治疗脑卒中相关神经血栓重要指标，但其作用机制还有待进一步探讨。