结肠癌中差异表达LncRNA-circRNA谱及生物信息分析

龙贺明

（赣南医学院第一附属医院肿瘤内科，赣州341000）

结直肠癌是我国最常见恶性肿瘤之一，发病率与死亡率逐年上升[1]，早发现早治疗是提高生存率的有效方式[2]。目前结直肠癌缺乏有效、特异的早期诊断和治疗靶标，有必要多方面探索结直肠癌的发病机制，以期筛选出特异性早期诊断生物标记物和治疗靶标。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年8月至2019年10月本院收治的3例确诊为结肠癌患者的癌组织和癌旁组织，经组织病理学诊断，并参照国际抗癌联盟UICC公布的第八版结直肠癌TNM分期标准确定，患者均为左半结肠腺癌T2期。患者术前未接受过放疗或化疗措施、无其他肿瘤史。本研究经赣南医学院第一附属医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署了书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 组织RNA提取 癌和癌旁组织采用TRlzol法提取总RNA。采用微量紫外分光光度法检测RNA纯度；Qubit2.0核酸蛋白定量仪测定RNA浓度。

1.2.2 RNA文库的制备及测序 采用Ribo-Zero r RNA Removal Kits移除总RNA中的rRNA。采用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit预处理RNA并构建测序文库，用Agilent2100生物分析仪进行质控和定量。文库变性为cDNA后在Illumina flowcell上原位扩增，随后用Illumina HiSeq测序仪进行循环测序。

1.2.3 mRNA、lncRNA和circRNA鉴定与差异表达基因筛选 测序得到的reads使用cutadapt 1.9.3软件和FastQC软件进行质量控制，使用Bowtie2 2.1.0软件[3]将reads映射到UCSC转录集，使用RSEM 1.2.15软件[4]评估基因表达水平。采用STAR软件[5]将高质量reads比对到参考基因组，使用DCC软件[6]评估、鉴定circRNA；用校正后的m值均值对基因进行归一化处理，使用EdgeR程序[7]对差异表达基因进行鉴定，要求P＜0.05，∣FC∣≥1.5。

1.2.4 差异表达mRNA、lncRNA和circRNA亲本基因功能富集 利用DAVID软件（https://david.ncifcrf.gov/）分别对差异表达的mRNA和circRNA进行基因本体分析（gene outology，GO）和京都基因与基因组百科全书分析 （Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）。

1.3 统计学分析 应用SPSS 22.0软件进行数据分析。正态分布计量资料组间比较采用独立样本t检验；非正态分布计量资料采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌中差异表达mRNA筛选与富集分析共注释并采用EdgeR程序筛选出3140条差异表达mRNA，差异性前5位见表1。聚类分析、GO分析与KEGG富集结果如图1所示。

图1 结肠癌与癌旁组织差异表达的mRNA.mRNA主成分分析图（A）；聚类热图（绿色为下调，红色为上调）（B）；KEGG通路富集分析（B）；GO分析（C）；KEGG通路网络关系。

表1 结肠癌与癌旁组织中差异性前5位mRNAs

2.2 结肠癌中lncRNA表达谱分析 共鉴定14835条lncRNAs，筛选出差异表达lncRNA 2381条，差异性前5位见表2。聚类分析结果见图2A。

表2 结肠癌与癌旁组织中差异性前5位lnc RNAs

2.3 差异表达lncRNA功能富集与通路分析2381条差异表达lncRNA的GO分析与KEGG富集结果如图2，可注释到320条途径。

图2 结肠癌与癌旁组织差异表达的lnc RNA.聚类热图（A）；KEGG通路富集分析（B）；GO分析（C）。

2.4 结直肠癌中差异表达circRNA筛选与富集分析 共注释鉴定出1438条circRNA，筛选出138条差异表达circRNA，差异性前10位见表3。聚类分析与GO分析结果如图3所示。通过KEGG富集到4条信号通路，即N-聚糖生物合成，PPAR信号通路，钙信号通路，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解。

图3 结肠癌与癌旁组织差异表达的circ RNA.circ RNA长度分布（A）;聚类热图（绿色为下调，红色为上调）（B）；KEGG通路富集分析（C）；GO分析（D）。

表3 结肠癌与癌旁组织中差异性前5位circ RNAs

3 讨论

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤，病因复杂，发病率和死亡率逐年上升[7]。在分子研究水平上，K-ras、c-myc、EGRF、P53等基因异常表达在结肠癌发生发展过程中扮演重要角色[7]。

lncRNA是一类结构高度保守的非编码RNA。RNA在结肠癌等诸多癌症中发挥重要作用[8-10]。本研究结果显示结肠癌组织中B3GALT5-AS1、FAM83H-AS1、H19、Linc01082等lncRNA均有显著差异表达，有研究证实上述lncRNA在促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用，包括影响结直肠癌对抗癌药物的耐药性[9]，促进癌细胞增殖等[11]。

CircRNA是非编码RNA的一大类，在肿瘤发生发展中起着重要的作用，如调控Hippo-YAP信号通路影响结直肠癌肿瘤增殖等[8]。在本研究中，KEGG通路富集显示差异表达CircRNA富集到4条信号通路，其中PPAR信号通路参与调控脂质代谢、炎症反应等疾病生理过程[12]。

本实验全转录组研究显示结肠癌与其癌旁组织中mRNA、lncRNA和circRNA表达谱均有显著性差异并影响多个肿瘤相关信号通路，其中一些特异性高表达基因其具体作用生理功能和相互调控关系有待进一步深入研究验证。