基于slit-RoBo信号通路探讨骨碎补总黄酮对诱导膜技术骨重建的作用机制

黄锦阳，吴凡，袁灵梅，曾志奎，戈阳华，熊伟，郭灵，潘斌

（1.江西中医药大学研究生院，南昌330004；2.江西中医药大学附属医院，南昌330006）

节段性骨缺损的重建具有挑战性，其治疗难度大、周期长、失败率及致残率高，困扰着临床骨科医生[1-2]。传统的治疗方法为：骨缺损＜5 cm多采用自体骨移植，而骨缺损＞5 cm的修复方法包括带血管自体腓骨移植和牵张成骨技术，但均存在一定的局限性[3-5]。Masquelet等[6]于2000年首次描述的诱导膜技术，已被临床证明是重建节段性骨缺损的有效手段。相关基础研究[7-8]发现诱导膜组织含有丰富的血供，并可分泌大量生长因子。丰富的血供对成骨至关重要，因新生血管在运输营养及排泄细胞代谢的垃圾的同时，可提供成骨所需的骨髓间充质干细胞 （Mesenchymal Stem Cells，MSCs）。最新研究[9]表明slit-RoBo信号通路在血管新生、干细胞调节等多个生理功能中起作用，且成骨细胞通过SHN3/SLIT3轴参与了CD31hiEmcnhi血管偶联成骨的过程。Gruber HE等[10]研究发现在诱导膜及新生骨组织中含有大量的成骨细胞，说明在诱导膜技术中很可能存在着slit-RoBo信号通路调控CD31hiEmcnhi偶联成骨机制。中药骨碎补具有补肾壮骨功效，在促进骨形成与骨修复方面疗效确切，同时具有促进诱导膜局部血管新生的作用。然而，骨碎补总黄酮对诱导膜技术骨重建的干预机制和靶点尚不清楚，有待进一步探究。本研究通过建立大鼠股骨Masquelet诱导膜模型并采用骨碎补总黄酮干预，检测局部成骨、血管新生和slit-RoBo信号通路相关关键细胞因子的表达，研究结果如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验采用48只SD大鼠（雄性SPF级），鼠龄8～10周，体重约260～280 g（由江西中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号SCXK[(赣)（2018-0003）]。大鼠分笼饲养，温度22～24℃，4只/笼，适应性喂养1周后进行实验。实验过程中对动物的处置遵照中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准，采用过量麻醉处死，动物尸体交由江西中医药大学实验动物中心处理。器材与试剂：自制不锈钢大鼠股骨6孔钢板及截骨导板，直径1.5 mm皮质骨自攻螺钉（江苏百舍医疗器械有限公司），总RNA提取试剂盒（上海Promega公司），PMMA骨水泥（国械注进20143656033），反转录试剂盒（美国Thermo公司）。药物：强骨胶囊(北京岐黄制药有限公司生产，国药准字Z20030007，0.25 g/粒，有效成分为骨碎补总黄酮)，青霉素（主要成分青霉素钠，80万U/瓶，国药准字H13020657）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及造模前准备 依据体重分层结果随机分为空白组、模型组、中药中剂量组、中药高剂量组4个组，每组12只（前期实验已表明中药中、高剂量组对诱导膜作用效果确切)。术前禁食24 h，不禁水。按体重予2%戊巴比妥钠腹腔麻醉（0.2 mL/100 g），左侧大腿青霉素8万U肌肉注射预防感染。

1.2.2 手术步骤 一期造模方法同笔者前期所发表文献[11]的手术步骤，除空白组外均放置骨水泥进行旷置。二期造模：于骨水泥旷置6周后进行，术前准备同前。75%乙醇消毒大鼠尾巴，铺无菌单，纵行切开，取两节段大鼠尾骨，剥离尾骨上附着组织、剪碎。沿大鼠右大腿原切口小心切开诱导膜，取出PMMA骨水泥块，于骨缺损区填充剪碎的尾骨粒（见图1），小心缝合诱导膜组织，防止尾骨粒散开，关闭伤口，8周后取材进行指标检查。

图1 造模及植骨过程

1.2.3 术后处理 术后禁食12 h，正常进水。每期手术后连续5 d，肌注青霉素8万U以预防感染。单笼饲养，5 d后予同组合笼。

1.2.4 药物干预 按动物等效服药量按体表面积计算，为78.75 mg（mg-1·d-1）。因此干预浓度分别为：高浓度157.5 mg（mg-1·d-1）、中浓度78.75 mg（mg-1·d-1）。使用纯水制成对应浓度溶液灌胃，按预期每500 g体重灌胃2 mL，予等量纯水对空白组、模型组大鼠进行灌胃。灌胃时间为二期植骨术后第2 d至第8周取材当天，1次/d。

1.3 指标检查

1.3.1 X线拍摄 二期植骨术后8周拍摄实验侧股骨标准正、侧位X片。拍片结果采用Lane-Sandhu法进行影像学评分，见表1。

表1 La ne-Sa ndhu X射线评分表

1.3.2 PCR检测新生骨组织中CD31、Emcn、slit3、ROBOm R NA的表达 每个样本称取100 mg左右冰冻新生骨组织液氮研磨成粉末状，采用Trizol提取样本组织总RNA，紫外分光光度计测定总RNA纯度浓度。荧光定量PCR检测新生骨组织中相关mRNA的表达情况，反应条件如下：95℃15 min，95℃15 s，60℃60 s延伸，40个循环，溶解曲线确认产物是否为特异性扩增。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料采取（±s），行正态性检验后，满足正态分布的组间数据比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的数据则采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验期间所有大鼠未出现死亡，4只大鼠伤口缝线在术后第1 d裂开，经对症处理后顺利愈合，亦无螺钉松动等并发症。

2.1 X线检查结果 空白组可见少量骨痂形成，不足骨缺损区域25%；模型组成骨约占骨缺损区域50%，骨折线部分消失，但重建皮质薄弱；中药中剂量组可见骨形成占缺损75%以上，骨折线模糊，尚见少许骨皮质未连续；中药高剂量组则骨形成充满缺损区，骨折线消失及骨皮质重建可（见图2）。

图2 各组大鼠股骨缺损区成骨X线比较

2.2 新生骨组织相关基因RT-PCR相对表达量模型组较空白组CD31、Emcn、slit3、ROBO m R NA的表达提高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而中药中、高剂量组相关基因的表达相比模型组明显上调（P＜0.05），见图3。

图3 各组新生骨组织中CD31、Emcn、s lit3、ROBOm R NA的表达

3 讨论

传统“二元调控”理论认为，成骨细胞与破骨细胞功能偶联调控骨形成与重建过程。但最新研究[12-13]发现成骨的微环境除成骨、破骨外，还与骨内血管新生有密切关系，其中CD31hiEmcnhi血管可调节骨内微血管生长、产生独特的新陈代谢和分子微环境，可维持血管周围的骨组细胞和偶联成骨，是具有调节成骨作用的新成员。

Slit-Robo细胞信号通路广泛存在于生物体内，与神经发育、血管生成、组织器官发育以及干细胞的增殖调节等均有关。Slit3是成骨细胞中发现的一种SHN3新型配体，最早发现于中枢神经系统中，可通过ROBO受体来调节神经轴突的生长，被证实为大鼠模型和人体组织工程中的促血管新生因子。既往研究[14-15]发现Schnurri3调节蛋白（adaptor protein Schnurri3，SHN3）可抑制成骨细胞活性，敲除SHN3基因小鼠模型可以募集大量的造血元素到骨痂处以致形成成熟的板层骨，这说明成骨细胞亦通过SHN3/SLIT3轴参与了CD31hi-Emcnhi血管偶联成骨的过程。诱导膜含有丰富的血管网，并存在大量的成骨细胞，故我们认为在诱导膜骨重建过程中很可能存在Slit-Robo信号通路调控CD31hiEmcnhi偶联成骨机制，值得进一步探究，查阅相关文献，尚无相关报道。

骨碎补是补肾法的代表药物，研究[16-17]表明其有效成分骨碎补总黄酮不仅可加速骨缺损区域骨组织重建，还可通过上调血管内皮舒张因子及VEGF的表达从而促进血管生成。本研究采用骨碎补总黄酮干预大鼠股骨Masquelet诱导膜骨重建过程。该研究X线影像学结果提示中药组较空白组和模型组骨缺损区骨痂形成明显增加，提示骨碎补总黄酮可促进诱导膜技术骨缺损区骨痂形成，加速其二期骨重建。同时研究还证实模型组新生 骨 组 织 中CD31、Emcn、slit3、ROBOm R NA的 表达较空白组提高，笔者认为空白与模型组对照也有阳性结果是由于模型组放置骨水泥后形成诱导膜，诱导膜中生长因子促进CD31hiEmcnhi血管新生，加速成骨。而中药高、中剂量组相比模型组有明显的上调，从而表明骨碎补总黄酮通过调控Slit-Robo信号通路介导血管偶联成骨，促进诱导膜技术二期骨重建。

综上所述，该研究肯定了诱导膜骨组织重建过程中CD31hi Emcnhi血管偶联成骨与Slit-Robo信号通路的相关性，初步揭示了骨碎补总黄酮促进诱导膜技术二期骨重建的分子生物机制。预期为中药干预诱导膜技术提供新靶点，有助于解决诱导膜技术二期移植骨血管化、矿化缓慢的关键性问题。