砷暴露心脏毒性及其防治研究进展

蒋璇璇，何 颖,钟高龙，伍少峰，万 方，宁芷君，胡 婷，陈忠伟，赵 武，卢冰霞，唐兆新，张 宁，胡莲美*

(1. 华南农业大学 兽医学院，广州 510642；2. 广西壮族自治区兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室，南宁 530001；3. 广西桂垦牧业有限公司，广西 南宁，530022)

砷(As)是一种金属元素，广泛分布于岩石、土壤、水和空气中，自然界中的砷化合物分为无机砷和有机砷，其中无机砷普遍存在于一些砷污染严重地区的地下饮用水中，且易在生物体内发生蓄积，且三价砷的毒性远远大于五价砷。随着重金属产量的急剧增加，受砷污染的地下水成为人类和动物在环境中接触砷的主要来源。此外，饲料也被认为是砷污染地区动物的砷来源。三氧化二砷(AsO)是一种常见的无机砷化合物，具有致畸致癌致突变的遗传毒性。AsO的用途十分广泛，AsO作为药物早期主要是用于治疗恶疮、鼠疫、疟疾等疾病。此外，在农业上也常用作消毒剂、除锈剂和杀虫剂。近期发现，AsO是治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)的有效药物，因此围绕AsO治疗过程的毒副作用的研究报道层出不穷。本文就近年来国内外对AsO心脏毒性的机制研究及其防治进行综述。

1 As2O3心脏毒性

自20世纪40年代中期以来，以砷为基础的药物作为促生长作用的饲料添加剂推广使用，但过量的砷暴露会导致动物发生中毒，且对心脏的毒性作用对动物的伤害尤为严重。研究表明，AsO心脏毒性作用主要表现为Q-T间期延长，其次是窦性心动过速、非特异性ST-T波改变和尖端扭转性心动过度，常见的急性副作用有胸腔积液和心包积液。严重情况下，会出现完全性房室传导阻滞，甚至导致死亡。此外，AsO还可以引起心脏的微量元素失衡，并损害线粒体功能，影响心脏的能量供应。

2 As2O3心脏毒性作用机制

2.1 As2O3诱发心脏组织学损伤

AsO对心脏组织的损伤比较明显。在光学显微镜下可观察到心肌细胞排列紊乱，肌间隙变宽，并可见多处心肌细胞大片重度凝固性坏死灶，胞膜受损，胞核固缩、变形或溶解，心肌纤维束间有大量出血。研究表明，心肌纤维化也是AsO引起的慢性心脏毒性的原因之一，目前研究其主要机制有两个，一个是通过激活AKT/GSK-3β/Snail信号通路诱导内皮细胞向间质转化；另一个是引起促纤维化因子TGF-β1表达增加，促进纤维细胞增殖。在透射电镜下可观察到大量的成纤维细胞，在细胞周围有大量的胶原沉积，并且心肌细胞染色质在核膜边缘浓缩，核膜破裂，细胞质空泡化；线粒体空泡化、嵴变形或丢失。

2.2 As2O3诱发心脏离子通道改变

AsO导致心脏电生理变化主要是通过改变L-钙离子通道(ICa-L)和钾离子通道。AsO被报道对心脏产生多种不良反应，包括Q-T间期延长、室性心动过速和心源性猝死，被认为与心脏离子通道的改变密切相关。Ficker等采用全细胞膜片钳和western blot方法，证明了AsO对Q-T间期的作用是通过增加心肌钙电流和抑制内质网中hERG蛋白的加工间接影响钾离子通道产生的。此外，陈锡创等对Wistar大鼠连续静脉注射AsO(0.8 mg/kg/d)7 d后，测定心肌细胞内钙浓度并通过全细胞膜片钳记录动作电位，进一步证明了AsO明显抑制大鼠心室肌细胞的钾电流(Ito，Ik1)，增大ICa-L电流，从而改变心脏动作电位的平台期，影响心肌复极化，同时提示Ito、Ik1、ICa-L是AsO致心律失常的潜在靶点。心肌纤维化也是AsO引起心脏慢性毒性的重要原因之一。最新研究表示，TGF-β1除了介导心肌纤维化外，也可以显著降低hERG和钾离子通道(IK1)电流密度和下调hERG和IK1的表达，提示TGF-β1信号的调节可能为AsO诱导的心脏电生理异常的治疗提供新的策略。众所周知，细胞内外的钙离子通道变化可以触发多种反应，包括肌肉收缩、酶反应、细胞增殖和基因转录等。Li等通过检测NF-κB炎症因子和钙离子通道蛋白，证明了AsO可以诱导鸡心脏发生钙离子超载和炎症反应，并且两者呈现正相关的趋势，具体机制有待研究。

2.3 As2O3诱发心脏氧化应激损伤

氧化应激是机体内促氧化剂与抗氧化剂之间平衡失调引起的一系列适应性的反应，过多的氧化剂导致氧化还原信号控制的中断和分子损伤。实验室主要通过检测ROS和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽相关酶(GSH，GST，GPx)等抗氧化物酶以及氧化产物丙二醛(MDA)水平等来评估机体氧化应激程度。砷由于其原浆毒作用，可以直接损害细胞器(线粒体、内质网)从而导致活性氧升高，过量的活性氧介导砷的许多有害作用，包括DNA损伤、氧化应激、脂质和蛋白过氧化、肿瘤发生等。Binu等用AsO处理雄性Wistar大鼠30 d后，可观察到心肌损伤，心脏功能指标异常，并且抗氧化物酶(GSH，GST，GPx)活性下降、丙二醛(MDA)水平升高，证明AsO诱导的心脏毒性与抗氧化系统损伤有关。核因子E2相关因子2(Nrf2)被认为是氧化还原稳态的调节因子，可被上游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)激活，从Nrf2/Keap1复合物中释放后由细胞质转运到细胞核中，与抗氧化元件(ARE)结合后可以增强抗氧化基因的转录，其中包括了血红素加氧酶-1(HO-1)。刘红艳等通过AsO干预白血病小鼠原代培养的心肌细胞后，发现AsO通过抑制Nrf2-ARE信号通路对心肌产生氧化性损伤。通过体内外实验，证明了AsO对心脏的氧化损伤途径是通过诱导磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的下调，抑制Nrf2的表达，从而下调了HO-1，影响心脏的抗氧化系统。

2.4 As2O3诱发心脏细胞自噬

自噬主要起到一种适应性作用，在基础条件下自噬活性维持在一个较低的水平，当机体受到各种外界刺激，如饥饿、缺氧、感染、氧化应激、激素药物刺激等，自噬会被显著上调，过度的自噬会对细胞造成不可逆的损伤，即自噬性细胞死亡。自噬是一个动态的过程，包括起始、延长、成熟、降解四个阶段。调节细胞自噬的分子机制复杂，其中Atg1/ULK1激酶复合物和mTOR诱导自噬体成核过程，Atg5-Atg12和Atg8-PE两个泛素化结合系统调节自噬泡的形成，PI3K激酶和Beclin1参与自噬泡膜的延伸和成熟。此外，“自噬通量”多用来作为检测自噬程度的指标，目前测量自噬通量的主要方法有监测LC3的转化率(LC3-II/LC3-I)和P62总细胞水平。AsO诱导的细胞自噬和氧化应激之间存在微妙的相互作用，砷损伤细胞器引起的ROS升高引起氧化应激，诱导自噬激活，激活自噬又能清除损伤的线粒体，从而抑制ROS诱导，起到保护作用。Li等在基础日粮中给1日龄的雄鸡灌服AsO(30 mg/kg)和CuO(300 mg/kg)12周，结果显示As/Cu都可导致心脏内出现自噬溶酶体、自噬空泡和双模结构，通过下调TORC1、TORC2、LC3-I和上调LC3-II、Beclin1、Atg5等自噬相关基因水平证明鸡心肌发生了自噬，并通过提高鸡心肌酶活性、诱导氧化应激和激活PI3K/AKT/mTORC途径，引起心肌损伤和自噬。目前看来，尽管砷对其他器官的损伤和细胞死亡机制已有大量的研究，但对砷诱导的心脏疾病的机制研究较少。

2.5 As2O3诱发心脏细胞凋亡

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序死亡，形态学特征包括细胞皱缩、染色质凝集、胞膜完整，DNA断裂，凋亡小体形成。目前已知的细胞凋亡途径主要有3条：线粒体通路(内源性途径)、死亡受体通路(外源性途径)、内质网通路。AsO诱导的细胞凋亡依赖于细胞类型、暴露时间和暴露浓度，当浓度达到0.5-2.0 μmol/L，凋亡可由多种机制触发。其中ROS线粒体破坏、caspase激活和MAPK信号激活是砷诱导凋亡的主要途径。Yu等在体内外证明AsO(1 mg/kg)可以引起心脏的氧化损伤，并且下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax和Caspase-3蛋白表达，触发线粒体依赖性的凋亡途径。此外，AsO还可引起大鼠心室肌细胞异常收缩和细胞内钙超载，诱导内质网应激介导的细胞凋亡。MAPK亚家族调节多种细胞增殖、分化和凋亡，包括ERK1/2、p38和JNK激酶。转化生长因子-β1(TGF-β1)可以通过调节Bcl-2和Bax蛋白以及MAPKs激活诱导细胞凋亡。研究发现，AsO可以诱导豚鼠心脏成纤细胞凋亡并引起TGF-β1蛋白表达和MAPKs激活，说明细胞凋亡可能受TGF-β1和MAPKs调控。Miao等也证明了AsO可以诱导H9c2心肌细胞发生凋亡，并显著激活MAPK-家族蛋白。

2.6 其他机制

近几年，对AsO心脏毒性的研究中加入了不少关于线粒体和能量代谢的研究，包括线粒体功能、线粒体动力学和线粒体发生，也凸显了心肌细胞拥有高密度的线粒体和重要能量供应源的特殊地位。研究显示，AsO暴露导致线粒体嵴紊乱和溶解，线粒体空泡化，并引起线粒体生成超氧化物，显著降低线粒体呼吸链复合物I、III、IV的活性，降低细胞耗氧率，从而影响ATP的生成，无法满足心脏的高耗能需求。ATP耗竭过程中，线粒体裂变增加，然而过度裂变会触发心肌的坏死和凋亡。

3 As2O3心脏毒性的防治

3.1 动态监测

AsO作为治疗药物使用时，心脏毒性的发生与剂量、作用时间和患者的身体状态有关。在使用AsO之前应对患者的心血管进行初步评估，药物治疗后1～2周内患者最易出现心脏不良反应，这个时期常常需要注意监测可能出现的心脏毒性。环境中的砷污染主要存在人畜饮用水中，研究表明，随着饮用水源砷含量的降低，环境水质改善，砷中毒症状和体征的改善率可能也会增加。因此，监测并改善砷中毒地区的水质对控制该病至关重要。

3.2 抗氧化剂的使用

目前大量的文献证明，AsO引起心肌损伤是由于受到过量的活性氧和自由基侵蚀导致的，因此抗氧化剂的使用也成为了缓解AsO引起的心脏毒性的重要措施之一，而针对减轻AsO心脏毒性的抗氧化剂的研究主要集中在内源性成分和天然植物提取物。

3.2.1 内源性活性物质 内源性活性物质是天然存在人类和动物体内的一类物质，包括激素、维生素、蛋白质和一些小分子物质等。开发内源性活性物质作为药物对疾病的治疗具有极大的实用价值，如今广泛使用的内源性药物多具有抗氧化、抗衰老的作用。金属硫蛋白(MTs)是一类普遍存在细胞内的金属结合蛋白。作为一种重要的抗氧化剂，MTs已被证明可用于保护糖尿病引起的心血管并发症，如糖尿病心肌病和阿霉素引起的心肌损伤。Miao等通过体内外实验证明，MTs对AsO诱导的心脏毒性具有保护作用，并通过完全抑制MAPK亚家族成员(p38、Erk1/2和JNK)激活和细胞凋亡，阻止AsO诱导心肌细胞死亡。硫辛酸(LA)属于B族维生素中的一种辅酶，存在于线粒体中。有报道过，LA通过对肾细胞的抗氧化作用改善AsO诱导的细胞毒性。此外，LA对心脏的保护作用在于减弱心肌钾离子流(I)的抑制从而改善AsO诱导的心脏Q-T间期延长。锌是机体必需的微量元素之一，Zhao等研究评估了Zn和AsO在鲤鱼心脏的相互作用，结果显示Zn可以降低心脏中ROS及MDA水平，增强抗氧化酶SOD、CAT活性，并通过MAPK途径抑制细胞内ROS簇，减轻AsO引起的心脏氧化损伤；此外，还验证了Zn可以通过PI3K/Akt/mTOR途径抑制Bax/Bcl-2、Caspase家族和LC3蛋白的表达，有效抑制AsO诱导的细胞自噬和凋亡。

3.2.2 天然植物提取物 许多中草药具有清除自由基、增强抗氧化系统的作用，这取决于中草药中的抗氧化成分，分为黄酮类化合物、酚类化合物、皂苷类、多糖类化合物、其他抗氧化成分。黄酮类化合物是绝大数植物内都含有的一种成分，药用价值丰富，可用于防治心脑血管疾病、解肝毒、抗自由基和抗氧化等。Yu等研究表明，花山梨黄酮类化合物(SPF)对AsO所致心脏毒性具有抗氧化保护作用，并通过激活PI3K/AKT通路介导Nrf2和HO-1的表达，增强抗氧化系统反应。SPF还可以调整Bcl-2蛋白下调和Bax和Caspase-3蛋白上调，有效抑制AsO诱导的细胞线粒体依赖性凋亡。研究发现丹参主要成分丹酚酸B可以改善经AsO作用后的H9c2心肌细胞活力，减少ROS的产生，并用PI3K抑制剂验证了丹酚酸B是通过激活PI3K/AKT信号通路，减少AsO诱导的H9c2心肌细胞凋亡。白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，主要存在于葡萄、桑葚、花生及红酒中，研究发现高剂量的白藜芦醇对AsO所致心脏毒性具有预防作用，其机制可能与增强机体内抗氧化酶活性及拮抗脂质过氧化有关。丁香酚被证明可减轻脂质过氧化，并恢复心肌膜上Na/K-ATP酶和Ca-ATP酶活性，改善AsO诱导的心率紊乱，纠正了心电图Q-T间期延长，对心脏起到保护作用。此外，粉防已碱和青蒿素也被证明可以改善AsO引起的心肌病理损伤和心电图Q-T间期延长。最新研究显示，南天竹总生物碱可以减轻AsO造成的心脏毒性并改善心脏功能。根皮素是存在于苹果、梨等水果果皮和根皮中的抗氧化成分之一，研究表明根皮素可以降低AsO诱导的H9c2心肌细胞ROS生成，增加抗氧化酶的活性，抑制Nrf2表达，显著减轻了AsO对心肌细胞的氧化损伤。此外，还可以有效增加细胞耗氧率和Ca-ATP酶活性，减轻AsO对心脏线粒体损伤和致凋亡作用。

综上所述，目前研究减轻AsO心脏毒性的药物主要基于氧化应激和心脏电生理学的改善，并且大多数药物只针对单一靶点研究，少有多靶点多通路的药效研究。此外，研究减轻AsO心脏毒性的药物种类较为局限。因此，仍需要开展新的药物研究和对药物新靶点及保护机制的深入探究。

4 展 望

许多研究表明，环境中的砷暴露导致的慢性砷中毒显著增加了人畜患心血管疾病的风险，而AsO作为APL和实体瘤的治疗药物，心脏毒性的评估一直是其在临床上应用的重要考虑。目前对AsO心脏毒性机制的研究还缺乏系统、全面、深入的探讨，多是局限于单一机制的研究，仍需要继续进行大量的基础研究和临床试验。药用植物是目前研究最多的抗氧化剂来源，由于其具有多成分多靶点且毒性低的特点，对于开发治疗AsO引起心脏毒性的有效方法具有良好前景。