马盲肠纤维素分解菌的分离鉴定与酶活分析

李村院, 李晓悦, 刘 夏,夏咸柱,乔 军,胡圣伟*

(1. 石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003；2. 石河子大学 生命科学学院，新疆 石河子 832003；3. 中国农业科学院 长春兽医研究所，吉林 长春 130122)

我国作为农业大国，每年的秸秆产量十分可观，纤维素作为秸秆的主要成分，具有难以降解的结构特点，导致其利用率非常有限。绝大部分秸秆直接在田间进行焚烧处理或因无法分解利用而废弃，这不仅极大程度上降低了秸秆资源的有效利用率，并给自然环境带来巨大威胁。因此，如何将纤维素转化为可利用的能源一直是人类不断探索的课题。目前降解纤维素主要采用反应条件温和且无污染的生物法，即利用微生物产生的纤维素酶降解纤维素。细菌由于具有生长速度快、操作简单、大规模培养成本低等优势而被广泛用于生产纤维素酶。因此，从自然界中筛选出能够高效降解纤维素的细菌一直是研究的热点。

马作为典型的后肠消化型食草动物，由于其具有役用、赛用、乳用和肉用等多种重要的用途而被广泛饲养在全球各地，其膨大的盲肠中共生了大量的微生物，在消化纤维素的过程中发挥了巨大的功能。同时，有研究表明在消化相同饲草的时候，后肠消化型动物比反刍类动物释放更少的甲烷和氢气，对环境更加友好。目前，已有大量研究报道，分别从梅花鹿、竹鼠、双峰驼、小龙虾、牦牛、羊、藏猪、鹅、大熊猫等多种动物的胃肠道或粪便中分离出了纤维素降解菌。然而，目前对马盲肠中微生物的研究相对匮乏。因此，深入研究马盲肠中的纤维素降解菌可能会为应对环境危机、能源危机、新型益生菌的开发等方面提供新的解决方案。

1 材料与方法

1.1 试验样本的采集

样本来源于昌吉市木垒县马场的18匹健康伊犁马的盲肠内容物，样本采集后快速放入灭菌的50 mL离心管中，并存放于车载冰箱中在4 ℃的条件下带回实验室用于纤维素分解菌的分离培养。

1.2 仪器设备

高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、摇床、烘箱、电子天平、离心机、水浴锅、PCR仪、微波炉、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱、磁力搅拌器、移液器。

1.3 纤维素分解菌的分离纯化

将采集的18个伊犁马盲肠内容物样本置于超净工作台中，取一个无菌三角瓶，每个样品称取0.1 g，共1.8 g置于三角瓶内，并于三角瓶内加入180 mL生理盐水混合均匀，在磁力搅拌器上均匀搅拌30 min，然后取一支无菌EP管，吸取搅拌后的粪便1 mL，即为10菌悬液，然后再取6支无菌EP管依次进行10倍连续稀释(10～10)，一共6个梯度，每个梯度吸取100 μL菌悬液均匀涂布在CMC-Na筛选培养基上，每个梯度做3个平行，并于37 ℃倒置培养24 h后观察培养皿中菌落生长状态。

挑选一个菌落生长合适的梯度，用接种针将该梯度培养基上所有的单菌落点种于LB发酵固体培养基上并做好标记，于37 ℃倒置培养24 h后，用1 mg/mL刚果红染色液染色1 h，再用1 mol/L NaCl溶液脱色30 min，观察菌落周边是否形成透明水解圈，测量每个单菌落的直径d和水解圈直径D，记录数据并计算水解圈与菌落直径的比值(D/d)。比值越大代表纤维素降解能力越强，选取水解圈直径与单菌落直径比值较大的菌株，进行划线纯化3次，然后在菌株的液体纯培养物中加入等体积的50%的甘油，于-80 ℃冰箱中长期冻存。

1.4 纤维素分解菌的复筛

从-80 ℃冰箱中取出冻存的菌株，接种于LB液体培养基中于37 ℃，180 r/min过夜震荡培养，然后再以1%的比例接种到LB液体培养基中，进行第二次活化，待菌液的D达到1.0时吸取2 mL接种到20 mL LB发酵液体培养基中，于37 ℃、180 r/min震荡培养48 h后，6 000 r/min离心15 min收集上清液，即为纤维素酶活测定的粗酶液。

1.5 CMCase(羧甲基纤维素酶)活力的测定

1.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制 用10 mg/mL葡萄糖标准溶液配制0.1 mg/mL～0.5 mg/mL的葡萄糖溶液，0 mg/mL的葡萄糖溶液为空白对照，取不同浓度的葡萄糖溶液各2 mL分别加入6支试管中，再依次加入2 mL蒸馏水和5 mL DNS溶液(索莱宝，北京)，将上述溶液混合均匀后于沸水浴中煮沸5 min，冷却至室温后用蒸馏水定容至25 mL，混匀后在540 nm波长处测定吸光度值。以吸光度值为Y轴，葡萄糖含量为X轴，绘制标准曲线。

1.5.2 酶活力测定步骤 将含1% CMC-Na的0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(0.05 mol/L柠檬酸钠54 mL、0.05 mol/L柠檬酸46 mL、CMC-Na 1 g、调pH至4.8)做为底物测定酶活性。反应混合物中包含0.5 mL底物溶液和0.5 mL酶溶液。在50 ℃下反应30 min，在反应混合物中加入1.25 mL DNS溶液停止反应。然后将反应混合物在100 ℃下煮沸5 min。用分光光度计测定D值。所得值与葡萄糖标准曲线进行比较。

式中：A为酶反应液的吸光度值；A为空白对照的吸光度值；C为标准曲线的截距；K为标准曲线的斜率；V为底物溶液的体积(mL)；t为酶解反应时间(min)，1000为转化因子(1 mmol=1 μmol)。

1.6 纤维素分解菌生化特征的测定

根据伯杰细菌鉴定手册对酶活力最高的前5株纤维素分解菌进行生理生化鉴定。将对数生长期的菌液接种至分别含0.5%葡萄糖、0.5%乳糖、0.5%半乳糖、0.5%麦芽糖、0.5%蔗糖、0.5%甘露醇、0.5%山梨醇、0.5%菊糖、0.5%纤维二糖、0.5%玉米支链淀粉的糖发酵基础培养基内(日本生物，青岛)，并于37 ℃培养箱中培养24 h后添加溴甲酚紫指示剂，观察颜色变化，紫色为阴性，黄色为阳性。同时，将对数生长期的菌液接种至不同固体培养基上(溴甲酚绿、七叶苷)，于37 ℃培养箱中培养24 h后并观察结果，不变色为阴性，溴甲酚绿变黄为阳性，七叶苷变黑为阳性。分别将新鲜的菌液穿刺于含LB发酵固体培养基的试管中和接种于含LB发酵液体培养基的密封注射器中，37 ℃培养箱中培养24 h后分别观察菌株的运动情况和产气情况。

1.7 纤维素分解菌生长特性

配制LB培养基，将菌液以1%的比例接种于液体LB培养基中，在37 ℃摇床中震荡培养，每隔2 h取菌液1 mL于600 nm波长处测定吸光度值，以未接菌的培养基作为空白对照，绘制生长曲线。

1.8 纤维素分解菌的16S rDNA分子鉴定

使用16S通用引物27F(5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增。PCR扩增体系包括： PrimeSTAR Max Premix (2×) 10 μL(Takara，大连)，上下游引物各0.5 μL，菌液0.2 μL，Nuclease-Free ddHO 8.8 μL。PCR扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 3 min。PCR反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确定产生大小正确且单一的条带后，将其送上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序后的序列在NCBI上进行BLAST比对分析，确定种属关系，然后用MEGA 7.0软件中的邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 纤维素分解菌的初筛

由表1可见，具有水解圈且D/d≥2的纤维素分解菌共计66株，其中CE83菌株的水解圈直径与菌落直径的比值最大，为3.67。

2.2 纤维素分解菌的复筛

酶活力的测定结果见表2。由表2可见，其中CE207酶活最高，达到14.81 U/mL，CE105酶活最低，为1.91 U/mL。

2.3 纤维素分解菌生化特征的测定

由表3可知，菌株CE3、CE41、CE83、CE176、CE207均可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、菊糖、纤维二糖、玉米支链淀粉，同时均能产酸，不能产气、不具有运动能力。此外，除CE41不能发酵半乳糖外，其余菌株均可。除CE3和CE41不能发酵七叶苷之外，其余菌株均可。

2.4 纤维素分解菌生长曲线的测定

由图1可知，CE3、CE41、CE83、CE176、CE207五株菌的生长情况有所差别，CE3在10 h左右到达生长平台期；CE41在20 h左右到达生长平台期；CE83和CE176在8 h左右到达生长平台期，CE207在10 h左右到达生长平台期。CE3、CE176和CE207在18 h后菌液浓度有所下降。CE41、CE83和CE207平台期浓度大于CE3和CE176。

表1 纤维素分解菌的水解圈直径与菌落直径的比值Table 1 The hydrolysis circle diameter and colony diameter of cellulose decomposing bacteria and its ratio cm

表2 酶活力测定Table 2 Enzyme activity determination U/mL

表3 生化特征测定Table 3 Determination of biochemical characteristics

图1 纤维素降解菌的生长曲线Fig. 1 Growth curve of cellulose-degrading bacteria

2.5 纤维素分解菌的分子学鉴定

采用基因测序技术对以上66个菌株进行分子学鉴定，使用细菌通用引物扩增出一条长度约为1600 bp左右的单一条带，将测序获得的序列在NCBI中进行Blast比对，选择数据库中相似度最高的序列作为菌株鉴定的最终结果。比对结果显示为大肠杆菌、短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、莫来芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、同温层芽孢杆菌、维尔兹芽孢杆菌、漳州芽孢杆菌。系统发育树见图2。由图2可知，CE3、CE41、CE83、CE176、CE207位于一个大的分支上，CE3、CE41与短小芽孢杆菌的遗传距离最近，CE83、CE176、CE207与漳州芽孢杆菌的遗传距离最近。

图2 纤维素分解菌的进化树Fig. 2 An evolutionary tree of cellulolytic bacteria

3 讨 论

纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，是构成植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界中储量最丰富也最廉价的可再生有机物质资源。纤维素酶是一种高活性的生物催化剂，能将天然纤维素降解成短链的小分子物质，最终转化为纤维二糖或单糖，从而提高饲料中纤维类物质的利用率，既可节约饲料资源，又可减少养殖业的排泄，对环境的可持续发展也起到一定的作用。自然界中纤维素酶的来源有三种，一种存在于植物的不同生长发育过程中；一种是动物来源的纤维素酶；另外一种来源于微生物，如细菌、真菌、放线菌等，它是人类最早认识的纤维素酶，其中微生物是纤维素酶最主要的来源。马作为大型草食性动物，肠道中的微生物尤其是盲肠中的微生物与其出色的纤维素消化能力有着密不可分的关系。马盲肠是马消化纤维素的主要器官，是微生物种类最多、分布最广的部位，也是细菌发酵的主要场所，纤维含量高的植物饲料在马的后肠通过微生物细菌发酵被降解为挥发性脂肪酸和短链脂肪酸等利于机体吸收的物质，因此盲肠被称为马匹的“发酵罐”。

本研究以CMC-Na为唯一碳源，筛选具备纤维素分解能力的细菌菌株，再通过刚果红染色后产生的水解圈与菌株的直径比值初步判断菌株的产酶能力，由于该方法快捷简单，成本低廉，因此被大多数研究者广泛采用。但是CMC-Na平板筛选法不能精准定量菌株产纤维素酶能力的大小，因此需要对初筛得到的菌株进行液体发酵，然后测量菌株的纤维素酶活性，根据酶活的高低进行复筛。试验初期，在CMC-Na平板上初筛得到D/d≥2的菌株共计66株，较多数量的富含纤维素降解酶的菌再次表明这些菌株在马的粗纤维饮食中受到了强烈的选择。根据酶活的高低挑选了5株高产纤维素酶的优势菌株，并对其进行生化特征和生长曲线的测定以及16S rDNA分子学鉴定。发现这5株菌具有良好的生长性能，基本在接种8 h后可以迅速达到平台期；可以降解包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、菊糖、纤维二糖、玉米支链淀粉在内的多种底物。广泛的底物适应性和快速的生长能力也表明这5株菌株是马盲肠中降解纤维素的优势菌株。进一步利用系统发育分析表明这5株细菌均为芽孢杆菌属细菌，CE41和CE83被鉴定为，CE90、CE176和CE207被鉴定为。其中漳州芽孢杆菌(CE207，14.81 U/mL)具有最高的产纤维素酶的能力。已有研究表明纤维素降解能力较强的菌株大多是芽孢杆菌。本研究从伊犁马盲肠中分离出的菌株除大肠杆菌外基本均为芽孢杆菌属细菌，该结果与其一致。苏少锋等从蒙古马盲肠内容物中分离筛选得到一株具有较高降解纤维素能力的解淀粉芽孢杆菌，酶活力为0.6 U/mL。Shakarami等从阿拉伯马的粪便中分离得到四株高产纤维素酶的纤维素分解菌，酶活最高的一株是多粘类芽孢杆菌(2.95 U/mL)。但是本研究分离的漳州芽孢杆菌具有更高的酶活，这可能与采样时期、样本来源以及采样时饲喂的高纤维素含量的粗饲料等有一定的关系。未来深入研究该菌株的产酶能力和其它的生物学功能具有较高的研究价值和实践价值。

4 结 论

本研究从伊犁马盲肠内容物中分离出66株好氧纤维素降解菌，主要为大肠杆菌和各类芽孢杆菌。