后海穴注射猪瘟疫苗的免疫效果分析

高晓娟，薛久洲，高 艳，刘万华，白艳艳，薛琳珏，白崇生，郝玉青，刘健鹏*

(1.榆林学院 生命科学学院，陕西 榆林 719000；2.榆林市动物卫生监督所，陕西 榆林 719000；3.榆林市动物疫病预防控制中心，陕西 榆林 719000)

猪瘟( Classical swine fever，CSF) 是一种由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的猪重要急性型与较为烈性的传染病，严重威胁着我国养猪业的健康发展。通过疫苗进行免疫则是目前预防和控制CSF发生和流行的重要手段和措施，该病的临床特征包括器官出血、坏死、梗死和纤维素性坏死性肠炎等，后期常继发副伤寒及巴氏杆菌病。猪瘟居我国猪五大传染病(猪瘟、伪狂犬病、蓝耳病、Ⅱ型圆环病毒病、口蹄疫)之首，严重影响着养猪业的发展。就目前而言，对CSF的预防仍然是通过疫苗免疫，在制定并执行相对固定的免疫程序、选择疫苗类型、免疫增强剂等方面应加以注意，但如何提高抗体水平、增强疫苗免疫效果是CSF防控中一直以来有待解决的关键问题。而穴位免疫是根据针灸与现代免疫学理论，经穴位注射抗原物质后，通过活化机体免疫系统，调节、增强免疫应答反应。其中，后海穴就是家畜一个常用的重要经络穴位，且经证实能有效提高抗体效价和放大疫苗免疫作用。在猪病防治中也有相关研究报道，黄庆洲等通过猪后海穴注射猪传染性胃肠炎疫苗，母猪初乳、常乳及免疫仔猪血清中IL-2的含量较口服组和肌肉注射组高。蒋圣姣等发现，后海穴注射口蹄疫疫苗的抗体效价优于肌肉注射对照组。张志成等发现，后海穴注射猪瘟兔化弱毒苗1头份效果比肌肉注射2头份的效果还好。因此，本试验采用后海穴注射途径对30日龄仔猪进行CSF疫苗免疫，分析其抗体水平和免疫效果，以期为生产中提高仔猪CSF免疫效果提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

CSF疫苗为猪瘟活疫苗(齐鲁动物保健品有限公司，济南，批号：150251004)，60头份/瓶。猪瘟正向间接血凝试剂盒(批号：20170504202)，购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.2 方法

1.2.1 试验动物选择及试验设计 选择健康无病、未免疫接种过CSF疫苗的30日龄PIC仔猪80头作为试验动物。将80头仔猪随机分为2组，每组40头，分别开展后海穴接种CSF疫苗效果研究和后海穴免疫接种CSF疫苗后抗体时序消长规律两个试验研究。

1.2.2 后海穴接种CSF疫苗效果研究 将40头30日龄PIC仔猪随机将其分为对照组和试验组2组，每组各20头，对照组通过颈部肌肉CSF疫苗(每头1头份)，试验组后海穴接种CSF疫苗(每头1头份)，(后海穴注射具体操作方法：在尾根与肛门中间凹陷的小窝处进针，且保持与猪的脊柱方向平行刺入，进针深度为1.5～3.0 cm。)接种30 d后，对每头试验猪进行前腔静脉无菌采血5 mL，分离血清，测定各组抗体水平。抗体合格率=(抗体合格样本数/本组样本总数)×100%，抗体水平≥5即为合格。

1.2.3 后海穴免疫接种CSF疫苗后抗体时序消长规律 将40头30日龄PIC仔猪随机将其分为对照组和试验组2组，每组各20头，分别通过颈部肌肉(对照组)和后海穴(试验组)接种CSF疫苗(每头1头份)，于7 d、14 d、21 d、35 d和60 d后分别无菌采集血，分离血清，测定各组抗体水平。

1.2.4 抗体检测及结果判定 该试验采用正向间接血凝试验(IHA)对CSF抗体进行检测，方法按照试剂盒使用说明书进行。结果判定：将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1∶16孔、稀释液对照孔，均应无凝集(红细胞全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点)或仅出现“+”凝集(大部分红细胞沉入孔底，边缘有少量红细胞悬浮)，阳性血清对照孔1∶2～ 1∶256 各孔应出现“++”以上凝集(大部分或全部红细胞悬浮孔内)，以呈现“++”血凝反应的血清最高稀释度作为该血清的间接血凝抗体效价。在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集(50%以上的红细胞出现悬浮)的血清最大稀释倍数为该血清的抗体效价，抗体效价达≥1∶32 (即25，第5孔)为合格。

1.4 数据处理

试验数据经Excel2007初步整理后，采用SPASS17.0统计软件进行方差分析，并用检验进行差异显著性分析，>0. 05表示差异不显著，<0. 01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 后海穴接种CSF疫苗效果研究

由表1知，试验组抗体合格率高达100%，对照组差异极显著，后海穴注射CSF疫苗的抗体水平明显高于肌肉注射(<0.01)。常规肌肉注射CSF后，免疫抗体合格率>70%，虽符合强制免疫要求，但是抗体水平不是很均一，疫苗的保护效果并不是很理想。

2.2 后海穴免疫接种CSF疫苗后抗体消长规律

由图1可以看出，在CFS疫苗接种后的整个抗体消长过程中，同一时间段，试验组的抗体效价均高于对照组，其中，第14天、35天时差异显著(<0.05)，第60天时差异极显著(<0.01)。且试验组的抗体平均效价在疫苗接种后第14、21、35、60天时均高于2(合格水平)，而对照组的抗体平均效价只有在疫苗接种后第21、35天时高于2。表明，在CFS疫苗接种后的整个抗体消长过程中，后海穴免疫注射较肌肉注射途径的抗体水平高，且抗体平均效价在合格水平以上出现的时间早，维持时间较长。

表1 CSF抗体效价检测结果Table 1 Results of CSF antibody titer test

图1 CSF抗体消长规律(n=20)小写字母不同表示差异显著(P<0.05)Fig.1 Growth and decline law of CSF antibodyDifferent lower case letters mean significant difference (P<0.05)

进一步分析CFS疫苗接种后的抗体消长规律发现，试验组和对照组的CFS抗体均呈现先上升后下降的趋势，且在疫苗接种第35天达到抗体效价峰值，但试验组的峰值高于对照组，二者在峰值前、后的升长与下降速度也显著不同。试验组的CFS抗体效价在峰值前的上升速度整体较对照组快(第14天到21天这一阶段除外)，其在第14天与21天间、第21天与35天间均差异显著(<0.05)，对照组只有第14天与21天间差异显著。而试验组在峰值后的下降速度较对照组慢，对照组在第35天与60天间差异显著(<0.05)，而试验组差异不显著。综合表明，后海穴免疫注射CFS疫苗与肌肉注射相比，抗体产生的速度较快、衰减速度较慢，且峰值高，维持时间长。

3 讨 论

由于新生仔猪CFS抗体可通过母乳获得，但CFS母源抗体随着仔猪断奶，在32日龄时显著降低，并确定在25～32 d进行首免较好。因此，本试验为了最大限度的避免母源抗体的影响，将30日龄仔猪作为试验动物进行首次接种。同时，由于疫苗接种后一般4～7 d产生抗体，且生产实际中多在60日龄进行二免。所以，本试验于CFS疫苗接种后30 d进行初步的抗体检测，并于接种后第7天开始至第60天分不同时间进行抗体效价追踪，以观察其产生、衰减速度，掌握消长规律。抗体水平的高低标志着猪体对疫病的易感程度，抗体峰值出现的迟早、持续时间长短表明不同的疫苗免疫效果。本试验通过抗体效价检测，证实后海穴免疫注射CFS疫苗后的抗体水平较同等试验条件、同等免疫剂量下的肌肉注射途径高，这与傅章伟的研究结果一致。而进一步的抗体追踪试验证实，后海穴免疫注射CFS疫苗后的抗体峰值较肌肉注射高，维持时间较长，更深入确凿地表明，CFS疫苗后海穴注射，可有效提高免疫效果。可见，后海穴是一个较敏感的免疫注射部位，比常规肌肉注射方式更容易激发动物机体的免疫系统，产生更强的免疫保护力。

虽然后海穴注射CFS疫苗有较好的免疫效果，但也存在一些不足。由于穴位范围很小，且要注意防止刺伤脊椎和直肠等原因，导致其操作要求较高、操作时间较长，且对猪的应激反应较强，再加上后海穴距离肛门较近，而肛门本身不清洁，使消毒烦琐，操作劳动量加大。因此，在后海穴注射CFS疫苗的生产实践中，应注意克服这些负面影响。