水貂BMP2基因克隆及序列相关分析

刘琳玲，涂剑锋，郑军军，张 如，宋姗姗，杨福合，王桂武

(中国农业科学院 特产研究所，特种经济动物分子生物学国家重点实验室，农业部特种经济动物遗传育种与繁殖重点实验室，长春 130112)

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是一种能诱导异位骨发生的糖蛋白。1965年，Urist等将去钙骨片段植入到肌肉中诱导新骨生成，从骨片段中提取到的活性物质，即骨形态发生蛋白首次被发现并命名；1979年，又从兔骨中分离出BMP2，BMP3和BMP7。Kulessa等研究发现BMP会抑制毛囊生长和调控毛囊毛干分化的作用。BMP2对脂肪分化、成骨分化、软骨生成和生长发育起着重要作用，可以促进骨组织和软骨的生成，对细胞信号转导和细胞凋亡有调节作用。1999年，Wilson等在毛囊毛干发现BMP2。研究发现，BMP2在老鼠的毛囊发育与生长中起到重要作用。2基因在内蒙古绒山羊绒毛脱落期次级毛囊的毛干周围强烈表达，在兴盛期不表达，说明参与抑制毛囊生长。谷博研究发现2在辽宁绒山羊次级毛囊发生、变化、生长和发育过程中起着重要的调控作用。

貂皮是中国东北三宝之一，素有“裘中之王”的美称。貂皮皮板优良，轻柔结实、毛绒丰厚、色泽光润。目前，貂种的退化现象比较严重，毛皮品质变差，毛绒稀疏、针毛变长，如何培育出优质貂皮的水貂品种为当务之急，有必要加深对貂皮的毛绒品质研究。丛波等研究表明，丹麦咖啡水貂针毛和绒毛都显著长于美国短毛黑水貂。本研究以短毛黑水貂和咖啡水貂为试验材料，采用直接测序方法分析2基因的单核苷酸多态性，并对2基因多态性与毛长性状进行相关分析，旨在寻找与毛长性状相关的遗传标记，为进一步研究水貂毛长性状的标记辅助选择提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

252只7月龄雄性水貂血样采自大连名威貂业有限公司。在水貂取皮期，心脏采血，用柠檬酸葡萄糖抗凝，-20 ℃冻存。全血基因组试剂盒提取基因组DNA，溶解于TE中， -20 ℃冻存。

1.2 试剂

全血基因组试剂盒、Marker和Taq DNA聚合酶均购于北京全式金生物技术有限公司。

1.3 引物设计及PCR扩增

根据雪貂2基因序列(GenBank数据库登录号: NW_004569172)为参考，用Primer Premier 5.0 软件在外显子1、2和3处各设计1对引物，由生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列、扩增区域和产物大小见表1。PCR扩增总反应体积为25 μL：上下游引物各0.25 μL，DNA模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.15 μL，10×缓冲液2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，dd HO 18.85 μL。扩增条件：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃ 变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 20 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃下保存。产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 PCR产物的测序

将PCR产物在1.5%琼脂凝胶中电泳后用胶回收试剂盒进行扩增片段回收，送生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

表1 引物序列及相关信息Table 1 The primer sequences and information

1.6 SNPs位点确定和基因型分析

利用DNAMAN软件对基因进行序列比对分析筛查SNPs位点。通过Chromas 5.0软件根据测序峰图进行基因分型。

1.7 数据处理与分析

利用Popgene1. 32软件和SPSS 19.0软件进行数据处理和分析。统计纯合度、杂合度、基因型频率和等位基因频率等群体遗传参数。利用SAS9.4软件对SNPs位点基因与毛长表型的关联分析，以<0.05为差异显著，<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 BMP2基因PCR扩增产物检测

利用设计的3对引物进行2基因扩增，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物(图1)，BMP2-1引物扩增片段长度为335 bp，BMP2-2引物扩增片段长度为390 bp，BMP2-3引物扩增片段长度为1 080 bp，与预期设计扩增片段长度大小一致。

图1 水貂BMP2基因3对引物PCR扩增产物电泳图M.DNA相对分子质量标准；1-6.产物;a.BMP2-1；b.BMP2-2；c.BMP2-3Fig.1 Electrophoresis of the products of BMP2 gene in mink from 3 pairs of primersM. DNA Marker；1-6.The products of BMP2 gene; a.BMP2-1；b.BMP2-2；c.BMP2-3

2.2 BMP2基因外显子的多态性检测

对测序结果进行比对分析，BMP2基因的外显子1、2、3未发现SNPs位点，内含子1发现一个SNPs位点。C159T位点有3种基因型(图2)：CC、TC和TT基因型。

2.3 群体遗传参数分析

由表1可知，CC基因型为短毛黑水貂和咖啡水貂的优势基因型。C等位基因为短毛黑水貂和咖啡水貂的优势等位基因。

由表2可知，C159T位点在短毛黑水貂群体中为中度多态(0.05>PIC>0.25)，而在咖啡水貂群体中表现为低度多态(PIC<0.25)。χ2检测结果表明，C159T位点在短毛黑水貂群体显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态，在咖啡水貂群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。

2.4 C159T位点与水貂毛长性状的关联性分析

C159T位点形成的不同基因型在2种水貂品种中差异不显著(>0.05)，推测该位点与水貂毛长性状无关联。

2.5 序列分析

对扩增的3个外显子序列和已发表的雪貂(NW_004569172.1)，人(NC_000020.11)，家鼠(NC_000068.7)，牛(NC_037340.1)，猪(NC_010459.5)，狗 (NC_006606.3)，马(NC_009165.3)，羊(NC_040264.1)9个物种的2基因核苷酸序列进行比对分析，构建系统发育树和同源性比较分析。

图2 CC、TC和TT基因型的测序峰图Fig.2 The sequence peak graph of CC, TC and TT genotypes

表1 BMP2基因C159T位点的基因型频率和等位基因频率Table 1 Genotype frequency and allele frequencyof BMP2 C159T locus

表2 2个水貂品种C159T位点遗传多态性Table 2 Genetic polymorphism of C159Tlocus in two mink breeds

表3 C159T位点基因型与水貂毛长表型的关联分析Table 3 Association of genotype of TC159T locus withhair length phenotype of mink

结果显示(表4)水貂与雪貂、狗同源性最高为98.2%，93.7%，与系统发育树的结果一致，水貂和雪貂亲缘关系最近。

3 讨 论

BMP2属于骨形态发生蛋白家族，是一种糖蛋白，包含2个内含子和3个外显子，其编码区域位于外显子2和3上。本研究发现不同物种间的2基因序列同源性较高。水貂与雪貂同源性最高为98.2%，且与其它哺乳动物的同源性都在81.2%以上，说明2基因保守性很强。水貂和雪貂都属于鼬科动物，亲缘关系最近。

图3 BMP2基因系统发育树构建Fig. 3 Phylogenetic tree construction of BMP2 gene

表4 BMP2基因同源性比较Table 4 Homology comparison of BMP2 gene %

BMP2是一个多功能蛋白，在动物机体内有广泛的生物学功能。随着近几年对BMP2研究的越来越深入，国内外科研人员对2基因在生长发育、繁殖性能、毛囊发育等的作用进行了大量研究。Devaney等研究发现,脂肪和肌肉质量的差异与人类在转录后2基因调控元件中的功能性多态性有关。冷丽等发现2基因内含子2的12 bp插入或者缺失位点对7周龄肉鸡的股骨重、胫骨长、腹脂重和腹脂率的表型变异有显著影响。魏强研究表明2基因与母猪繁殖力显著相关。BMP2是毛囊诱导的抑制物，在毛囊发育的休止期表达量高，对毛囊发育起到抑制作用。

本研究对2基因的3个外显子设计了3对引物，通过PCR产物直接测序检测对2种水貂品种进行了多态性分析，在外显子2和3中未发现多态性。这与以前的研究结果一致。王凭青等采用PCR-SSCP技术检测2基因外显子2、3在山羊4个品种中均没发现多态性。钟昕在2基因CDS区进行了多态性检测，未发现多态性位点。检测2基因外显子1、2和3的部分区域，未发现突变。初步推断，2基因的外显子1、2和3序列相对保守。说明2基因的三个外显子区域不是影响毛长的功能结构区域，但是不排除其它区域有引起功能改变的突变位点，需要进一步的研究。