池永宽,刘旭光,熊康宁*,肖 华,陈 浒
(1.贵州师范大学 喀斯特研究院/国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心, 贵州 贵阳 550001; 2.贵州省喀斯特山地生态环境国家重点实验室培育基地, 贵州 贵阳 550001)
肉牛产业是我国典型生态脆弱区(黄土、荒漠、寒区、喀斯特)的重要经济支柱,其经济价值的实现是生态治理取得突破的重要体现,生产性能的提高和品质的改善直接关乎人民的切实利益。然而随着牛肉市场需求的扩大,现代养殖业和相关研究过度关注于提高肉牛的生产性能,忽略了品质的改善,使得不同肉牛的胴体性状差异较大,不利于培育高档肉牛,影响产业价值的进一步提升。肉牛的胴体主要由肌肉组织、脂肪组织、结缔组织和骨骼组织四大部分构成,其中肌肉与脂肪是消费者选择和购买最多的部分。国内外科研工作者依据色泽、pH、系水力、眼肌面积、大理石花纹、脂肪颜色和质地等评价指标对肉牛肌肉和脂肪组织这两部分的性状改善进行了大量研究报道。本文综述了对这些肉质性状具有重要影响的候选基因,旨在为今后培育高档肉牛提供理论参考。
牛肉色泽是肉中肌红蛋白与氧气结合时所呈现出的颜色与光泽,肉色等级主要取决于肌红蛋白的含量和存在形式。因氧气含量和血红素辅基中铁离子状态的变化,肉中肌红蛋白会先后以肌红蛋白、氧合肌红蛋白和正铁肌红蛋白的形式存在。通常,以氧合肌红蛋白所表现出的樱桃红为最佳。
pH是肉中糖元酵解乳酸积累的结果。pH作为衡量肉品质的一个重要指标,不仅影响牛肉的嫩度、系水力和适口性,还与风味、色泽显著相关。研究表明,牛肉极限pH对肉色等级具有至关重要的影响,一般以5.4~5.6为最好。此外,pH的降低还可以减少微生物的滋生,利于肉类保存。
嫩度是最重要的评价牛肉品质的性状之一,主要受结缔组织含量、肌纤维类型及比例和肌浆蛋白含量及化学结构的影响。
系水力是指牛肉不因外力作用而使原有水分丧失的能力,通常以百分比(%)表示。牛肉的系水力与肌内脂肪含量和蛋白质含量密切相关,一般含量越高保水性越强。系水力是牛肉的一个重要经济性状,它不仅影响鲜肉的色泽、适口性和营养成分,也影响加工时的产量。
眼肌面积是指牛屠宰后倒数第一、二胸肋间背最长肌的横切面面积,与牛的活重、胴体重、分割肉重、屠宰率以及净肉率均呈显著的正相关,其遗传力估计值为0.6~0.7。因此,生产中通常以眼肌面积来表明胴体中肌肉的比例和质量,是预测胴体产量的一个关键指标。
大理石花纹又称脂肪杂交,指肌内脂肪在肌肉组织中分布所形成的大理石状花纹,由肌内脂肪的含量和分布数量决定。国内外研究表明,大理石花纹决定牛肉的风味和嫩度,并认为与牛肉的多汁性和营养价值密切相关。肌内脂肪的含量越高、分布越均匀,越受消费者的青睐,是评价牛肉质量等级的一个重要指标。
牛肉脂肪以洁白有光、质地坚实为最好。脂肪颜色取决于植物性饲料中胡萝卜素和叶黄素的含量,一般含量越高牛肉脂肪色泽的等级越好。牛肉脂肪质地则与不饱和脂肪酸密切相关,不饱和脂肪酸含量低时脂肪质地坚实而硬,适宜进行牛肉的深加工。
瘦素(Leptin,LEP),是一种由白色脂肪组织合成、分泌的蛋白质类激素,为肥胖基因的表达产物,和哺乳动物的体脂率密切相关,在皮下脂肪、大网膜、后腹膜和肠系膜都大量合成分泌,其它组织则少量表达。基因定位于牛4号染色体的q32区,基因总跨度约18.9 kb,包含有3个外显子,共编码167个氨基酸,其编码区位于第2外显子和第3外显子。基因在脂质代谢和能量平衡中起重要作用,通过调空摄食行为、能量消耗和脂肪分解而影响体重、嫩度、肌内脂肪含量等指标。因此,基因的突变必然会对畜禽的胴体性状和肉品质产生影响。目前为止科研工作者已对牛基因多态性及其与胴体性状和肉品质的相关性进行了大量研究,Schenkel等为验证前人的研究成果,对杂交公牛、小母牛的5种SNP(UASMS1、UASMS2、UASMS3、E2JW和E2FB)基因型进行分析,结果表明E2JW和E2FB位点的多态性对嫩度、瘦肉率和脂肪等级影响显著或极显著。姜长生以新疆褐牛为试验对象,利用PCR-RFLP方法对基因第2外显子E2JW和E2FB两个位点的SNP进行检测,结果表明这两个位点存在多态性,其中E2JW位点的多态性对肌内脂肪含量和剪切力影响较大。萨吉代姆·麦麦提的研究也表明这两个位点存在多态性,且显著影响牛的体尺性状和胴体性。李锋为探讨肉牛候选基因多态性与屠宰性状的关系,对西门塔尔牛3、4、基因的多态性进行检测,发现3和4基因无多态位点,基因存在S978、S3521、S3822和S4091四个多态位点。相关性分析表明,S978突变会显著影响肌内脂肪含量,S3521突变既与肌内脂肪含量相关,又显著影响胴体重和眼肌面积。
硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD),属于脱氢酶家族,是一类存在于细胞内质网上,对哺乳动物机体中脂肪酸的形成和含量具有重要影响的基因家族。目前已发现的哺乳动物基因家族包括SCD1、2、3、4和5这5个亚型,不同的物种拥有多种亚型。人基因在10号和17号染色体上各有一个座位,基因总长约24 kb,包含SCD1和SCD5 2个亚型。牛基因也有2个亚型(SCD1和SCD5),其中普通牛1基因位于26号染色体,基因长17 088 bp,包括6个外显子,共编码359个氨基酸。水牛的1基因包含6个外显子,但在染色体上的具体位置尚不明确。目前关于牛基因的表达研究主要集中在1,5的研究较少。牛1主要在脂肪细胞和乳腺细胞中表达,与机体脂质代谢密切相关。唐慧等利用PCR技术对蜀宣花牛、巴山牛和安杂牛三个种群共计30头牛1基因的表达量进行了研究,并分析其与肌内脂肪含量的相关性。结果表明,牛背最长肌组织中该基因的表达量与不饱和脂肪酸含量显著正相关。Ferreira等探讨高含油性湿酒糟对F1安格斯-内洛牛肉质性状的影响,实验表明随着高含油性湿酒糟在日粮中比例的增加,胸最长肌中的大理石花纹减少,1等脂肪生成基因的表达降低,但对牛肉嫩度和颜色无影响。张海波等研究牦牛肌内脂肪含量与脂质代谢相关基因表达的相关性,发现外脊通过增加1基因的表达,促进肌内脂肪的沉积,增加肌肉组织嫩度,从而改善肉品质。同时,SCD1作为饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸的关键酶,对产奶量和乳脂成分也有显著影响。
二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)是一种广泛存在于真核生物体内的微粒体酶,也是催化二酰甘油和脂肪酰辅酶A合成甘油三酯的唯一关键酶和限速酶,在细胞甘油脂质的代谢中起重要作用。DGAT主要有二酰甘油酰基转移酶(DGAT1)和二酞甘油酞基转移酶(DGAT2)两种亚型。1基因定位于牛的14号染色体,基因总跨度14 117 bp,含有17个外显子,mRNA序列共编码489个氨基酸,由245 bp的5'-UTR、275 bp的3'-UTR以及1 470 bp的编码序列组成。它在乳腺、睾丸、小肠、皮肤以及脂肪组织中具有较高的表达量,被认为与牛的乳脂率、脂肪含量和大理石花纹等存在相关性。田璐等利用PCR-SSCP方法对3个黄牛品种及4个杂交肉牛1基因第17 exon和3'UTR的多态性进行测定,发现3'UTR的8 402 bp、8 414 bp、8 445 bp、8 465 bp和8 545 bp存在SNP突变。通过和肉质性状的相关性分析发现,8 402 bp位点的突变和眼肌面积、大理石花纹、肌内脂肪含量等指标显著相关,该位点CC基因型个体大理石花纹和肌内脂肪含量显著BB型,而眼肌面积BB型基因个体要显著高于CC型。武香香发现中国西门塔尔牛1基因多态性和肌内脂肪含量显著相关,与K等位基因相比,具有A等位基因的个体有更好的肌内脂肪含量和剪切力值。Kong等报道,韩宇肉牛1基因存在K232A和T11993C两个多态位点,相关性分析表明这两个位点的交互作用对大理石花纹的等级具有显著影响。此外,Bernard等和Thaller等的研究结果也论证了1基因对牛奶乳脂率具有影响这一观点。牛的DGAT2定位于BTA15q25-26,基因长31 456 bp,包含8个外显子,在肝脏、肾脏以及白色脂肪组织中具有较高的表达量,主要参与机体组织的脂肪代谢。目前关于DGAT2的研究主要集中在与泌乳性状的相关性分析方面,因此2和1都被视作奶牛产奶性状的候选基因。
脂肪酸结合蛋白(FABP)是一类广泛存在于哺乳动物细胞质中,对长链脂肪酸具有高亲和力的低分子量可溶性蛋白质,主要参与脂类代谢和脂肪的沉积调控。脂肪酸结合蛋白广泛存在于脊椎和无脊椎动物中,目前在哺乳动物中已经发现9种具有不同结构和功能的FABP,普遍认为基因家族中对家畜肌内脂肪含量(肌内脂肪含量影响肉的嫩度、风味、剪切力、多汁性和大理石花纹等)影响最大的是脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)和心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)。
普通牛的-基因定位于14号染色体,基因全长4 391bp,包含4个外显子,共编码132个氨基酸,主要在脂肪细胞和巨噬细胞中表达,与甘油三酯的合成、分泌以及脂肪的代谢密切相关。刘艳妍等在秦川牛群体中,对-基因5'侧翼区的1 441bp序列,使用DNA直接测序和PCR-SSCP进行结合的方法检测到转录起始点位上游-389 bp处存在1个SNP位点,分析发现该位点BB基因型个体的大理石花纹显著优于AB和AA基因型,有利于该群体的遗传育种。唐红杰对陇东肉牛-基因第2外显子和第3外显子上发现的多态位点进行了检测及其与肉质性状的相关性分析,发现第2外显子的突变点位与与剪切力相关,第3外显子的GG基因型个体的剪切力、蒸煮损失、pH都显著高于GC和CC基因型。刘瑞莉等对布莱特黑牛肌肉组织中-基因表达量和肌内脂肪含量进行测定,研究表明该基因在背最长肌中具有很高的表达量,且其多态性与肌内脂肪含量显著相关,但对大理石花纹等级的影响较小。-基因定位于牛的2号染色体,含有4个外显子,共编码133个氨基酸,主要在心脏组织中表达,对甘油三酯的沉积和脂肪酸的摄取起重要作用。李武峰等采用PCR-RFLP方法对3个杂交牛的-基因第2内含子进行多态性检测,发现1006位点存在C→G突变,其中基因型对大理石花纹和嫩度有显著相关性。周国利等使用测序技术与酶切位点相结合的新方法,在鲁西黄牛-基因第2内含子上发现1处突变。分析表明,该位点不同基因型间肉质嫩度差异显著,但对大理石花纹等级无显著影响。李志才等对湘西黄牛-基因多态性与大理石花纹和肌内脂肪含量的相关性差异进行分析,结果发现个体为纯合基因型时,大理石花纹等级最优,肌内脂肪含量最高,H-FABP基因的多态性对湘西黄牛的大理石花纹和肌内脂肪含量有显著影响。
CAPN即钙蛋白酶,是一类存在于生物细胞质中依赖钙离子激活的蛋白酶,pH7.2~8.2,它在机体各组织中普遍表达。目前已经发现CAPN基因家族中的16种亚型,广泛存在于动物机体中的有2种,CAPN1(μ-钙蛋白酶)和CAPN2(m-钙蛋白酶)。它们分子质量接近,分别拥有2个和4个结构域,都有一个30 ku的小亚基和一个80 ku的大亚基组成,小亚基相同,大亚基则是两个相关基因的产物。此外,二者激活活性时所依赖的钙离子密度不同,CAPN1所需钙离子密度为1~2 μ moL/L而CAPN2为250~750 μ moL/L。由GenBank公布的序列可知,牛的CAPN1和CAPN2都定位于29 号染色体连锁群着丝粒末端56 cm处。其中1基因长约11 kb,包含24外显子和23个内含子,共编码716个氨基酸。钙蛋白酶对动物体内各种肌纤维蛋白质的降解起重要作用,是导致肌肉嫩化的主要因素。动物屠宰后,肌质网释放出钙离子,引起细胞质中游离钙离子密度显著升高,激活钙蛋白酶,导致肌纤维蛋白质降解,增加肉质嫩度。Page等发现牛CAPN1中存在两个错义突变,一个是第9外显子316位点发生G→C突变,使氨基酸由甘氨酸变为丙氨酸,另一个是第14外显子530位点发生A→G突变,导致编码氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸,当标记的核苷酸分别为C和G时,牛肉嫩度显著提高。姜昊在中国草原红牛CAPN1第5外显子3717位点找到一个A→G突变,显著影响肉质性状,其中G为优势等位基因,GG基因型个体肉质嫩度显著高于AG、AA基因型个体。华金玲等研究显示,在牛的肌肉剪切力上携带B等位基因的个体显著高于携带A等位基因的个体,但在其它肉质性状方面差异不显著。近年来也有研究表明,牛1基因SNPs对pH、色泽、眼肌面积和大理石花纹等具有显著影响。
钙蛋白酶抑制蛋白(CAST),是一种依赖钙离子激活的胞内专一性抑制CAPN活性的蛋白质,和依钙蛋白酶及骨骼肌特异性钙蛋白酶共同组成钙蛋白酶系统。CAST包含5个结构域,即由N末端的L区和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区构成,L区对CA起输送调节作用,Ⅰ~Ⅳ为抑制依钙蛋白酶活性的功能区,其抑制能力:Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ。根据哺乳动物CAST的DNA片段在N末端编码区的差异,可将其分为TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ和TypeⅣ四种类型,而牛的CAST则被测定为TypeⅡ型。定位于牛的7号染色体,包含30个外显子和31个内含子,在细胞内普遍表达,主要参与肌肉细胞的生长代谢,通过抑制CAPN的自溶而影响牛肉的肉质性状。在畜禽屠宰后胴体的嫩化过程中,CAPN被钙离子激活,附近的CAST会与之结合,影响自溶的稳定性,导致CAPN只对局部的肌纤维蛋白质进行溶解。随着熟化程度的加深,CAST活性会逐渐降低,肉质会变得鲜嫩多汁。Woodward等通过对比牛宰前和宰后CAST的活性发现,宰后24 h牛背最长肌CAST活性与宰前肩胛骨表面肌CAST活性相似,为活体组织预测肉品质的方式提供了支撑。Gandolfi等也论证了CAST活性与牛肉的嫩度显著相关,可以作为嫩度指标的候选基因。同时相关研究表明,基因的多态性与牛肉嫩度也存在很大的相关性。张立敏在2010年对620头西门塔尔牛进行全基因组关联分析,在基因内或基因20 kb范围内发现7对剪切力具有显著影响的多态位点,其中BovineHD070028690位点对肌内脂肪含量也有显著影响。华金玲等利用DNA直接测序法检测皖东牛基因的多态性,并分析其与肉质性状的相关性。研究发现,皖东牛基因第9外显子和第8内含子存在5个突变位点,拥有CT和CC两个基因型,不同基因型个体间除肌肉嫩度外其它肉质性状差异不显著。Lee等为验证基因的多态性位点对牛肉质嫩度的影响,利用TaqMan-SNP分型技术对韩宇肉牛的基因多态位点进行测定,并通过WBSF实验评估胸长肌和半膜肌的嫩度,结果表明,1和基因中存在2个与剪切力值相关的多态位点。验证了CAST基因的多态位点可以用作标记辅助选择。
生肌调节因子(MRFs),或称生肌决定因子家族,是一类只在骨骼肌细胞中表达,参与肌肉发生过程的相关基因,家族中包括生肌决定因子(MyoD)、肌细胞生成素(MyoG)、生肌因子5(Myf5)和生肌因子6(Myf6)。MRFs家族成员被定位于牛的不同染色体,基因定位于15号染色体,基因定位于16号染色体,5基因和6基因都定位于5号染色体,它们均含有3个外显子和2个内含子,其第1外显子都存在Basic 和 HLH 结构域。该基因家族参与调控肌细胞分化和生长发育的整个阶段,5和在肌肉生成初期表达,控制肌祖细胞的定型和成肌细胞增殖,而和6则在肌肉形成末期表达,负责成肌细胞分化为不同功能型的肌纤维。肌纤维类型和比例与色泽、剪切力、肌内脂肪含量等指标密切相关,因而MRFs被认为是影响畜禽经济性状和肉质性状的候选基因,并进行了大量的研究。
和5主要通过调控肌卫星细胞的增殖分化来影响肌纤维的粗细和数量,故其位点突变可能会对与肌肉相关的肉质性状产生影响。田璐等用PCR-SSCP对3个黄牛品种和4个杂交肉牛群体的基因SNP进行检测,发现基因第二内含子39 bp和112 bp存在SNP突变。通过和肉质性状的相关性分析发现,第2内含子的SNP对肉牛胴体重、净肉重和眼肌面积的影响差异显著,该基因座中这些性状AA基因型个体均显著高于AB型,但AA基因型个体的嫩度、大理石花纹和肌内脂肪含量等指标均低于AB型。甘乾福以8个品种的牛为试验对象,利用PCR-RFLP技术检测MRFs家族基因的多态性,并分析其与胴体性状和肉品质的关系。结果表明,基因多态性与眼肌面积显著相关,BB基因型个体的眼肌面积显著优于AB型和AA型个体。杨晓冰研究利木赞杂交牛育肥屠宰指标和5基因的相关性,发现12月龄牛的5基因多态性对宰前活重、胴体重等屠宰指标的影响差异显著,且不同基因型个体之间的眼肌面积差异极显著,但该基因的多态性对24月龄牛的屠宰指标无明显影响。因而该研究结果也进一步论证了5基因只在肌肉形成初期表达的观点。通过控制成肌细胞和肌纤维的发生来影响肌肉分化,其多态性与畜禽的生长速度、产肉率等经济性状都密切相关。王珊基于基因克隆、电子克隆和PCR-RFLP技术,对秦川牛及其杂交后代共计4个群体基因的SNP进行检测,并分析其与生长发育性状的相关性。发现-基因座多态位点对生长发育性状有显著影响,在群体内部AA基因型个体的宰前活重、胴体长等指标显著高于AB型,即A为优势等位基因。薛梅等研究表明,基因的单核苷酸多态性对黄牛尻长、体高、体斜长等体尺性状也有很高的相关性。目前关于Myf6的相关研究较少,一般认为该基因可协同家族成员、和5对肉质性状产生影响。
生长激素(GH)是一种广泛存在于脊椎动物体内,由脑垂体前叶合成并分泌的蛋白质类激素。它的表达量受生长激素基因调控,直接或经由生长激素介质间接对靶细胞发挥作用,可以参与糖类、脂质和蛋白质的代谢调节,在机体生长发育中起着关键性作用。基因定位于牛的19号染色体,基因总跨度约2 856 bp,包括5个外显子,在机体各组织中普遍表达,其单核苷酸多态性与牛的生产性能和肉质性状等均存在一定程度的关联性。牛志刚等利用PCR-RFLP对新疆褐牛基因第5外显子进行了研究,结果发现新疆褐牛GH/Alu Ⅰ位点为中度多态性,存在VV、LV和LL 3种基因型。相关性分析表明,该多态位点对新疆褐牛早期生长发育性状具有影响,不同基因型个体间体重和体长差异显著。谷朝勇研究了鲁西黄牛基因第3外显子末端序列的多态性以及多态位点与生产性状的相关性,结果发现2639位点发生C→G突变,存在AA、AB和BB 3种基因型。关联分析结果表明,该突变位点与牛的体重、体高、胸围、体斜长和肉用指数等生产性状差异显著。张超等利用PCR-RFLP方法和DNA测序技术研究中国西门塔尔牛基因P3位点的多态性以及多态位点对经济性状的影响,结果发现该位点发生C/G颠换,存在AA、AB和BB 3种基因型。相关性分析表明,中国西门塔尔牛GH-P3位点对胴体重、净肉率、背膘厚等经济性状影响显著。郝灵慧利用PCR-RFLP技术检测草原红牛群体GH基因的SNPs,并分析其多态位点与胴体性状之间的相关性。研究发现在眼肌面积性状中,基因3'UTR多态位点与眼肌面积显著相关,其中BB基因型为优势基因型,可作为潜在的分子DNA标记。赵敬贤等通过关联分析研究发现,基因P3位点的多态性与雪龙黑牛个体的牛腩厚和脂色等级显著相关,可将其作为与牛脂肪颜色和质地性状相关的候选基因。
过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα),主要在肝脏、骨骼肌和棕色脂肪组织等线粒体脂肪酸氧化速率快的组织表达,是调节机体脂类代谢的关键蛋白。Everett等敲除小鼠PPARα,发现该鼠会出现脂类代谢功能紊乱的情况,说明PPARα对调节脂肪酸氧化和细胞外脂质代谢具有重要作用。樊月圆等利用PCR-SSCP结合测序技术发现,秦川牛基因第5外显子138位点存在一个错义突变,拥有AA、BB和AB 3种基因型。相关分析结果表明,AA基因型个体具有更好背膘厚和眼肌面积,BB基因型与系水力差异显著。同家族成员PPARβ/δ与PPARγ也被认为和体内脂质代谢相关,但不如PPARα在各组织部位分布广泛。
磷酸甘油酰基转移酶6(AGPAT6)属于溶血磷脂酸酰基转移酶家族,在机体许多组织中都存在,但主要表达于乳腺和褐色脂肪组织,是脂质代谢的关键酶。研究发现小鼠缺乏AGPAT6会出现厌食行为和脂肪生成障碍,不仅机体相应组织部位TAG含量大幅下降,肌内脂肪中的DG和TG也会减少。龙小娟采用PCR-SSCP方法分析6基因多态性与肉牛经济性状的关联性,发现中国西门塔尔牛6基因存在E1-303T>C和E12-299G>A两个多态位点。相关分析结果表明,E1-303T>C位点与胴体pH、脂肪颜色、亚油酸含量以及脂肪覆盖率显著相关,E12-299G>A位点与大理石花纹评分显著相关。说明6对脂肪酸合成有重要影响,可能是影响牛肉肉质性状的候选基因。
血管生成素样蛋白3基因(3)属于血管生成素样蛋白家族,是一种主要在肝脏表达的分泌性糖蛋白,通过对脂蛋白脂酶活性的控制而参与脂质代谢调节。研究发现,敲除3基因会导致小鼠出现低血脂症状,对其注射重组蛋白又可短时间内快速提升血脂,说明3有调节血脂的作用。此外,Fujimoto等认为Angptl3还与脂肪产生相关。胡鑫等研究发现,中国西门塔尔牛3基因第4外显子存在一个SNP位点(G7358C),有CD和DD两种基因型,其中C是优势等位基因。关联分析表明,该位点不同基因型与眼肌面积、脂肪覆盖率、肌内脂肪含量和大理石花纹评分差异显著。研究也表明该位点呈现低度多态性,在改善肉质性状中具有很大的选择潜力。
综上所述,虽然现阶段针对肉牛肌肉组织和脂肪组织性状改善的遗传选育工作存在基因联合研究不足、技术体系不健全、产学研融合深度不够等问题,但是相较于传统育种方法,动物分子标记育种可以快速、高效的选择绘制与质量性状相关的基因组区域,通过调控基因组合来提高育种的准确性和时效性。基因组学技术的发展给肉牛遗传改良工作注入了新的动力,大量与胴体性状相关的基因不断被发现,相信随着上述问题的解决,这些与肉质性状相关的基因必将有助于培育高档肉牛,进一步推动我国畜牧业的发展。